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(共23张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
学习目标
1.概述基因工程的基本操作程序。
2.说明利用PCR技术扩增目的基因的基本过程。
3.理解基因表达载体的结构和各部分的作用及基因表达载体的构建。
4.举例说明获取目的基因的途径,目的基因导入受体细胞的方法、检测与鉴定目的基因的方法。
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉与普通棉花
问题探讨
基因工程的基本操作流程
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
目的基因的检测与鉴定
将目的
基因导入受体细胞
一、目的基因的筛选与获取
1.目的基因：
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
3.目的基因获取：
从基因文库中获取
人工合成
反转录法
通过DNA合成仪合成
基因组文库
cDNA文库
利用PCR技术获取和扩增
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。
2.目的基因筛选：
利用PCR技术获取和扩增
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
①概念：
③条件：
②原理：
DNA半保留复制
（1）DNA（目的基因）模板。
（2）分别与模板DNA相结合的两种引物。
（3）A、T、G、C四种脱氧核苷酸。
（4）耐高温的DNA聚合酶。
（5）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
（6）能严格控制温度的温控设备。
耐高温的DNA聚合酶
引物
DNA模板
C．延伸
温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
④过程
B．复性
温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
A．变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。
待扩增的DNA片段
DNA分子就以2n的形式增加
⑤结果
琼脂糖凝胶电泳
⑥鉴定
PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,利用该方法可以使目的基因迅速扩增,其简要过程如图所示。下列关于PCR技术的叙述,错误的是(　　)
A.PCR和体内DNA复制都需要模板、能量
B.由PCR的反应过程可知,与氢键相比,磷酸二酯键对高温的稳定性更强
C.PCR和体内DNA复制都要消耗4种脱氧核苷酸和2种引物
D.PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C
理解巩固
1.目的：
2）使目的基因能够表达和发挥作用
2.组成：
1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以 遗传给下一代
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心
a.目的基因
b.启动子
c.终止子
d.标记基因（抗生素抗性基因）
表达特定性状
位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始
位于基因的末端,终止转录
检测目的基因是否导入受体细胞
e、复制原点：DNA聚合酶结合位点
3.过程：
两个切口
获得目的基因
质粒
DNA分子
限制酶处理
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
思考:表达载体为什么一定要有启动子？
生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；
(2)通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。
位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
启动子：
操纵基 因
结构基因
启动子
RNA聚合酶
理解巩固
1.转化：
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程
受体细胞
稳定
表达
2.方法：
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
三、将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
①特点：
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
②转化过程:
具有趋化性（酚）
导入植物细胞：
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
基因枪法
单子叶植物
花粉管通道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
导入动物细胞：
显微注射技术
——受精卵
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
移植到输卵管或子宫
受精卵发育
新性状动物
导入微生物细胞：
（1）微生物作受体细胞原因：
（2）常用法：
Ca2+处理
常用菌：
大肠杆菌
（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）
（3）过程：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。
科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是( )
①该技术将导致定向变异
②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来；
③将目的基因导入受体细胞时采用显微注射技术；
④受精卵是理想的受体
①②④ B. ①③④
C. ②③④ D. ①②③④
B
理解巩固
1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
（1）方法:
DNA分子杂交
（2）过程:
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的
基因已插入染色体DNA中。
（一）检测
15N
15N
变性
变性
四、目的基因的检测与鉴定
如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法:
分子杂交
②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,
表明目的基因转录出了mRNA。
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交
蛋白质
脱分化
提取
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
抗体
出现杂交带
（二）鉴定
——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法不正确的是( )
A. cDNA文库的构建需要用到逆转录酶
B. 图中的菌落是通过稀释涂布平板法获得的
C. 核酸分子杂交的原理是碱基互补配对
D. 从该文库中可以筛选到胰高血糖素基因
D
理解巩固
小结
基因工程的操作程序
1.目的基因的筛选和获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
筛选
获取
过程
组成
动物
植物
微生物
检测
鉴定

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