资源简介

第1节 植物细胞工程
第2章 细胞工程
科技探索之路 | 细胞工程的发展历程
细胞工程的概念：
应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
原理和方法
操作水平
目的
分类
细胞生物学、分子生物学和发育生物学
细胞器、细胞或组织水平
获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品
植物细胞工程和动物细胞工程
科技探索之路 | 细胞工程的发展历程
哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功。
斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体
古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚。
卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。
1902年
1958年
1960年
1964年
1971年
1974年
一 植物细胞工程的基本技术
从社会中来
“其茅葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨（dài）夫花开，凝晴滚露，万态千妍，薰（xūn）风自来，四坐芬郁，岂非入兰室乎！岂非有国香乎！”这是我国历史上第一部兰谱——《金漳（zhānɡ）兰谱》（宋·赵时庚）中对兰花的一段描述。从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢养兰花。但是，兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
植物组织培养技术
一、植物组织培养技术
（1）概念：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
（3）体现细胞全能性的标志：
细胞 → 完整个体或其他各种细胞
在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性的原因？
在特定时间、空间条件下，基因的选择性表达。
（4）全能性大小比较：
分化程度越高，全能性越低
1.植物细胞工程的理论基础
——植物细胞的全能性
植物细胞的全能性>动物细胞全能性
受精卵>胚胎干细胞>生殖细胞(精细胞、卵细胞)>体细胞
（2）细胞具有全能性的根本原因：
生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全部遗传物质。
一、植物组织培养技术
（1）概念：
（3）一般过程：
指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
（2）理论基础：
植物细胞的全能性
2.植物组织培养技术
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
生殖方式：无性生殖分裂方式：有丝分裂
离体培养的植物器官、组织或细胞被称为外植体
探究?实践 - 菊花的组织培养
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
根、芽等
试管苗
驯化移栽
完整植株
1.实验原理：
（1）植物细胞一般具有全能性。
（2）在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织接种到含特定激素的培养基上，就可以诱导其再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株。
相关概念
①脱分化：
在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变为未分化的细胞，进而形成愈伤组织的过程。
②愈伤组织：
脱分化形成的不定形的薄壁组织团块。
③再分化：
愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程。
特点：细胞排列疏松无规则、高度液泡化、色浅，具有较强的分裂能力
（3）植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
1.实验原理：
探究?实践 - 菊花的组织培养
生长素/细胞分裂素
结果
比值高(＞1)
比值低(＜1)
比值适中(=1)
有利于根的分化，抑制芽的形成
有利于芽的分化，抑制根的形成
促进愈伤组织的形成
生长素类作用：用于诱导细胞的伸长生长和根的分化；
细胞分裂素类作用：促进组织细胞的分裂或从愈伤组织和器官上分化出不定芽。
探究?实践 - 菊花的组织培养
2.材料用具
①外植体：
幼嫩的菊花茎段
（容易诱导形成愈伤组织）
②体积分数为70%的酒精：
对手、超净工作台、外植体进行消毒
③质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液：
对外植体进行消毒
④无菌水：
清洗外植体
⑤培养基（P116--参见本书附录1）
包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）。
蔗糖的作用：
提供营养
灭菌方法为：
湿热灭菌法
维持培养基的渗透压
固体培养基
探究?实践 - 菊花的组织培养
3.方法步骤
探究?实践 - 菊花的组织培养
3.方法步骤
消毒
①双手和超净工作台台面：
用酒精擦拭
②外植体:
流水冲洗
→酒精消毒30s
→无菌水清洗2～3次
→次氯酸钠溶液处理30min
→无菌水清洗2～3次。
外植体切段
将消过毒的外植体置于无菌培养皿中
→用无菌滤纸吸去表面的水分
→用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。
探究?实践 - 菊花的组织培养
接种外植体
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。
用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
【注意】接种时注意外植体的方向，不要倒插！
将“形态学上端”朝上，下端朝下
3.方法步骤
脱分化——诱导愈伤组织
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
【注意】该过程一般不需要光照
培养基及培养条件：
激素比例1：1；
有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织。
提供有机碳源（蔗糖）
探究?实践 - 菊花的组织培养
再分化——诱导生芽生根
培养15～20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上培养。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
【注意1】诱导顺序：先诱导生芽，再诱导生根！
【注意2】该过程每日需要给予适当时间和强度的光照！
移栽培养
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
3.方法步骤
探究?实践 - 菊花的组织培养
4.实验结果分析与评价
（1）接种3～4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，有多少能正常生长，试分析它们被污染的原因。
培养基、接种工具灭菌不彻底；
外植体消毒不彻底；
操作过程不符合无菌操作要求等。
（2）从刚接种的外植体到长出愈伤组织需经历多少天？
2周左右
（3）你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？
生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。
培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷酒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率，看看移栽是否合格。
探究?实践 - 菊花的组织培养
5.进一步探究
若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？
① 空白对照：不加任何激素；
② 实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；
③ 实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；
④ 实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。
离体
无菌
一定的营养、激素
适宜的外界条件(温度、pH、光照等)
外植体
愈伤组织
根、芽或胚状体
试管苗
脱分化
再分化
黑暗
光照
探究?实践 - 菊花的组织培养
若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。
【总结】植物组织培养中细胞表现出全能性的条件
（1）离体:
（2）严格的无菌条件：
①对操作环境、双手、外植体进行消毒；②对培养基和器械进行灭菌；③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行。
（3）适宜的培养条件：
（4）适宜浓度和比例的激素：
（5）一定的营养条件：
温度，光照
包括有机营养成分、无机营养成分
主要是生长素和细胞分裂素
避免杂菌迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物的生长。
脱分化避光：有光照容易产生维管等组织不利于形成愈伤组织。
再分化需光：有光照有利于叶片内叶绿素的合成。
探究?实践 - 菊花的组织培养
1.A、B过程分别为 。C是 。
A过程细胞分裂方式是 ，
B过程细胞分裂方式是 ,同时也进行 。
A过程一般 光照；B过程需要光照，因为 。
2.影响A、B过程的关键因素是 ，主要是 和 ，二者添加的 会影响脱分化和再分化过程。
3.植物组织培养是一个 过程。（填“无性繁殖”、“有性繁殖”）
植物体
根、芽或胚状体
外植体
有丝分裂
细胞分化
植物激素
细胞分裂素
生长素
无性繁殖
A B
有丝分裂
浓度及比例
【练习】下列是植物组织培养流程图，请回答：
C
脱分化、再分化
愈伤组织
不需要
叶绿素的合成需要光照
二、植物体细胞杂交技术
欲培育地上长番茄和地下结马铃薯的“超级作物”。你有什么妙招？
利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
不能。因为不同种物种之间存在着生殖隔离。
有没有方法可以打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，获得“番茄-马铃薯杂种植株”呢？
马铃薯
番茄
二、植物体细胞杂交技术
1.过程
①去壁原因： 。
②方法： 。
③相关酶： 。
*为什么用上述酶？______________________________________________
*酶解法利用了原理？_______________
*纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定
浓度的无机盐离子和甘露醇，试分析原因？
细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合）
酶解法
纤维素酶和果胶酶
植物细胞的细胞壁主要由纤维素和果胶构成
酶的专一性
使溶液具有一定的渗透压，防止原生质体吸水过多而涨破，保持原生质体正常。
（1）去除细胞壁
等渗溶液
原生质体
细胞壁
细胞膜
细胞质
液泡
细胞核
二、植物体细胞杂交技术
方法：
物理方法：电融合法、离心法
化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
理论基础：细胞膜具有流动性
（2）原生质体间的融合
1.过程
融合的原生质体重新产生细胞壁，形成杂种细胞。
验证再生出新壁的实验：
质壁分离和质壁分离复原实验
（3）细胞融合完成的标志：
去壁
融合
原生质体
融合的原生质体
杂种细胞
再生壁
可能出现的融合结果：
（只考虑两两融合时）
A番茄
B马铃薯
二、植物体细胞杂交技术
拓展：融合细胞类型的分析
①A种原生质体与B种原生质体融合后，有哪几种类型（只考虑两两融合）？而我们需要的是哪种类型？所以原生质体融合后，我们要进行怎样的处理？
有 种融合类型：
AA、BB、AB
我们需要的是？
AB
3
培养基中共有 种类型的细胞？
因此要对融合后的原生质体进行 。
筛选
AA、BB、AB
A、B
5
例：若植物A的基因型是AaBb，植物B的基因型是aaBb，则只考虑细胞之间的两两融合，则融合形成的细胞基因型有 种，分别是?
AAaaBBbb
aaaaBBbb
AaaaBBbb
√
二、植物体细胞杂交技术
拓展：融合细胞类型的分析
②若A细胞具有2x条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb。B细胞含有2y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，则通过植物体细胞杂交技术获得的新植株：
染色体条数？
染色体组数？
基因型？
属于可遗传变异类型中的？
2x＋2y
4个
AabbccDd
染色体数目变异
两亲本染色体数之和
两亲本染色体组数之和
两亲本基因型之和
异源多倍体
二、植物体细胞杂交技术
拓展：有性杂交与植物体细胞杂交的比较
植物A体细胞染色体数20条
植物B体细胞染色体数40条
有性杂交
后代体细胞中染色体数 条
植物体细胞杂交
后代体细胞中染色体数 条
植物A为二倍体植物B为四倍体
有性杂交
后代为 倍体
植物体细胞杂交
后代为 倍体
30
60
三
六
植物体细胞杂交
杂交育种
1.白菜（2N=18）与甘蓝（2N=18）体细胞杂交所得植株白菜-甘蓝的细胞染色体数为 ，属于 倍体。
36
（异源）四
2.白菜（2N=18）与甘蓝（2N=18）进行杂交（相互授粉），所得植株白菜-甘蓝的细胞染色体数为 ，属于 倍体。
（异源）二
18
二、植物体细胞杂交技术
去壁
融合
原生质体
融合的原生质体
杂种细胞
再生壁
脱分化
再分化
植物细胞融合
植物组织培养
愈伤组织
杂种植株
杂种细胞的形成是不是意味着植物体细胞杂交就完成了呢？
还要进行植物组织培养过程。
因此,植物组织培养是植物体细胞杂交的基础。
思考讨论
二、植物体细胞杂交技术
1.过程
植物细胞融合 + 植物组织培养
去壁
去壁
融
合
再生
新壁
脱分化
再分化
移栽
植物细胞融合
植物组织培养
植物体细胞杂交
二、植物体细胞杂交技术
2.植物体细胞杂交的概念：
植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
原理：
基础技术：
变异类型：
成功标志：
优点：
细胞膜的流动性和植物细胞的全能性
植物组织培养
获得杂种植株
染色体数目的变异
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。
二、植物体细胞杂交技术
3.植物体细胞杂交存在的问题：
有些杂种植株还未按照人们的意愿表现出亲代的优良性状。
"番茄—马铃薯"杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么?
生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以"番茄—马铃薯"杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。
练习与应用
1.下图是利用甲、乙两种植物的各自优势，通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是（ ）
A.进行a处理时能用胰蛋白酶
B.b是诱导融合后得到的杂种细胞
C.c是培养后得到的具有耐盐性状的幼芽
D.进行d选择时要将植株种在高盐环境中
A
2.科学家在制备原生质体时，有时使用蜗牛消化道提取液来降解植物细胞的细胞壁。据此分析，蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分?
纤维素酶和果胶酶。

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