资源简介

(共25张PPT)
第4节 蛋白质工程的原理和应用
第3章 基因工程
从社会中来
你见过用细菌画画吗？右图是用发出不同颜色荧光的细菌“画"的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为在它们的体内导入了荧光蛋白的基因。最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。 那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？
科学家解析了多管水母绿色荧光蛋白的晶体结构，并利用计算机进行辅助设计，在此基础上再采用定点突变的技术将绿色荧光蛋白发光基团正下方的第203位的苏氨酸替换为酪氨酸，从而获得了一种新的绿色荧光蛋白的衍生物--黄色荧光蛋白。
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
基础:
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
操作方法及对象:
改造或合成基因。
结果:
改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质。
目的:
改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
蛋白质工程的实质:是对编码蛋白质的基因进行改造。
相关学科及技术：
分子生物学、晶体学和计算机技术。
蛋白质工程的概念:
一、蛋白质工程崛起的缘由
1.基因工程的实质及不足
①实质：
基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者可以产生它原本不能产生的蛋白质，进而表现出新性状。
②不足：
基因工程原则上只能生产自然界中已存在（天然）的蛋白质。
2.天然蛋白质的不足
天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域重大的国际合作科研项目。2001年，国际人类蛋白质组组织宣布成立。2003年，该组织正式提出启动两项重大国际合作项目：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是由美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。
“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔重大国际科研协作计划。它的目标是通过对肝脏蛋白质高通量、规模化的研究，解析肝脏蛋白质在生理、病理过程中的功能意义，为重大肝病的预防、诊断、治疗和新药的研发提供重要的科学依据。
人类蛋白质组计划取得的成果有力推动了蛋白质工程的发展，为它提供了重要的理论支持。2014年6月，中国人类蛋白质组计划启动。
【旁栏思考】你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承担了什么任务？
一、蛋白质工程崛起的缘由
一、蛋白质工程崛起的缘由
实例：对天然酶的改造
赖氨酸合成
调控
达到一定浓度
两种酶的活性
352位的苏氨酸变成异亮氨酸
二氢吡啶二羧酸合成酶
天冬氨酸激酶
+
104位的天冬酰胺变成异亮氨酸
赖氨酸含量
抑制
提高
提高
限制
提高
提高5倍
提高2倍
二、蛋白质工程的基本原理
1.目标：
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造，由于基因决定蛋白质，因此，对蛋白质的结构进行设计改造，最终通过改造或合成基因来完成。
思考：为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？
①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大；
②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质；
③基因可以遗传，蛋白质无法遗传；
RNA聚合酶分子模型
二、蛋白质工程的基本原理
2.天然蛋白质合成过程：
按照中心法则进行
转录
DNA
RNA
翻译
肽链
逆转录
复制
复制
折叠等
具有空间结构的蛋白质
表达生物特有的功能或性状
蛋白质只有具有一定空间结构，才能表达特有性状或具有特定功能。
三
级
结
构
一
级
结
构
四
级
结
构
二
级
结
构
二、蛋白质工程的基本原理
3.蛋白质工程的基本思路
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
预期功能
生物功能
设计
蛋白质
（三维结构）
推测
改造或合成
转录
翻译
折叠
行使
目的基因
mRNA
多肽链
逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反
二、蛋白质工程的基本原理
思考 讨论
蛋白质工程基本思路的应用
某多肽链的一段氨基酸序列是：
丙氨酸
色氨酸
赖氨酸
谷氨酸
苯丙氨酸
1.怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列 请把相应的碱基序列写出来。提示：丙氨酸（GCU、GCC、GCA、GCG)、色氨酸(UGG)、赖氨酸(AAA、AAG）、谷氨酸（GAA、GAG）、苯丙氨酸（UUU、UUC）。
mRNA序列为：GCU（或C或A或G）UGG AAA（或G）GAA（或G）UUU（或C）
DNA序列为：CGA（或G或T或C）ACC TTT（或C）CTT（或C）AAA（或G）
GCT（或C或A或G）TGG AAA（或G）GAA（或G）TTT（或C）
二、蛋白质工程的基本原理
确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
2.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
思考 讨论
蛋白质工程基本思路的应用
人工合成目的基因
①反转录法
mRNA
单链DNA
双链DNA（目的基因）
反转录
合成
②化学合成
已知蛋白质的氨基酸序列
mRNA的
核苷酸序列
目的基因的
脱氧核苷酸序列
目的基因
推测
化学合成
DNA合成仪
推测
二、蛋白质工程的基本原理
确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。
2.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
思考 讨论
蛋白质工程基本思路的应用
通过构建基因文库来获取目的基因。
基因文库
含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
基因组文库
部分基因文库：主要是cDNA（互补DNA）文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系
基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；
②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
预期蛋白质功能
目的基因
蛋白质工程和基因工程的比较
三、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面
（1）研发速效胰岛素类似物
天然蛋白质易形成二聚体或六聚体
预期功能
降低胰岛素的聚合作用
设计结构
改变B链第20～29位氨基酸组成
改造
新胰岛素基因
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
推测序列
转录
mRNA
翻译
多肽链
行使功能
速效胰岛素类似物
预期结构
折叠等
阻碍胰岛素从注射部位进入血液，延缓了降血糖作用
三、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面
（2）延长干扰素体外保存时间
天然干扰素不易保存
改造
新干扰素基因
预期功能
延长保存时间
设计结构
氨基酸替换
一个半胱氨酸变成丝氨酸
推测序列
预期结构
转录
mRNA
折叠
翻译
多肽链
行使功能
在-70℃下可以保存半年
（3）降低人对小鼠单抗隆抗体的免疫反应
问题：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应，从而导致治疗效果大大降低。
解决办法：通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。
三、蛋白质工程的应用
3.农业方面
2.其他工业方面
4.面临的困难：
蛋白质工程是一项难度很大的工程。
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。
5.前景展望：
原因：
练习与应用
一、概念检测
1.蛋白质工程可以说是基因工程的延伸。判断下列相关表述是否正确。
（1）基因工程需要在分子水平对基因进行操作，蛋白质工程不需要对基因进行操作。（ ）
（2）蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列。（ ）
（3）蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。（ ）
2.蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到的目的是（ ）
A.分析蛋白质的三维结构 B. 研究蛋白质的氨基酸组成
C.获取编码蛋白质的基因序列信息
D.改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求
3.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在这项替换研究中，目前可行的直接操作对象是（ ）
A.基因 B.氨基酸 C.多肽链 D.蛋白质
×
×
√
D
A
练习与应用
二、拓展应用
T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高T4溶菌酶的耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。这项工作属于什么工程的范畴 在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是什么 如果要将该研究成果应用到生产实践，还需要做哪些方面的工作
练习与应用
二、拓展应用
这项工作属于蛋白质工程的范畴。引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是基因的碱基序列发生了变化。如果要将改造后的T4溶菌酶应用于生产实践，还有很多工作需要做。例如，由于改造后酶的空间结构发生了变化，因此它的一些基本特性需要重新明确，包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等;需要建立规模化生产该酶的技术体系，评估生产成本等。
复习与提高
1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因( AmpR)、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。
注: LacZ 基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X - gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色;否则菌落为白色。
复习与提高
请根据以上信息回答下列问题。
（1）在第②步中，应怎样选择限制酶
应选择用相同的限制酶或切割能产生相同末端的限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，并且注意限制酶的切割位点不能位于目的基因的内部，以防破坏目的基因，限制酶也不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复制原点等结构。
（2）在第③步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质
加入DNA连接酶。
复习与提高
（3）选用含有AmpR和LacZ基因的质粒进行实验有哪些优势
该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。
（4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什么颜色 为什么
含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达，形成β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解。
复习与提高
2.科学家将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES细胞的培养基上培养这些细胞。2~3周后，这些细胞显示出ES细胞的形态、具有活跃的分裂能力，它们就是iPS细胞。请回答下列问题。
（1）在这个实验过程中，逆转录病毒的作用是什么
（2）如何证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用
逆转录病毒是载体，能将外源基因0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4送人小鼠成纤维细胞。
可以设置对照组。将转入外源基因和没有转入外源基因的细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。如果只有转入外源基因的细胞转化成了iPS细胞，就可以证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用。
复习与提高
（3）如果要了解Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因在诱导产生iPS细胞时，每个基因作用的相对大小，该如何进行实验 请你给出实验设计的思路。
（4）若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给该病人治病，这是否会引起免疫排斥反应 为什么 iPS 细胞具有分裂活性，用它进行治疗时可能存在什么风险
可以依次去掉1个基因，将其他3个基因转入小鼠成纤维细胞中，然后通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的那个基因对诱导产生iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。
不会引起免疫排斥反应，因为在诱导转化的过程中细胞的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是“自体”细胞。
iPS细胞有分化为各种细胞的潜能，因此存在分化成肿瘤细胞的风险。
复习与提高
3.水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他们提出了以下两种方案。
方案一 把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而减少氮肥的施用量。
方案二 直接将固氮相关基因导入水稻细胞中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，这样就可以免施氮肥了。
请评估这两种方案哪种更容易实现。
从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。

展开更多......

收起↑