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(共66张PPT)
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
基因1 基因2 基因3
背景知识 - 基因的结构
DNA片段
放大
基因通常是有遗传效应的DNA片段；
能编码特定的蛋白质
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
启动子
终止子
1.编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。
2.非编码区 ：
一、原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
含有能调控遗传信息表达的DNA序列。
不转录，不编码蛋白质；
背景知识 - 基因的结构
启动子
终止子
一、原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
本质：
位置：
作用：
背景知识 - 基因的结构
二、真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列
背景知识 - 基因的结构
三、真核生物基因的表达
真核生物的DNA转录形成的mRNA需要在细胞核加工处理成为成熟的mRNA后才能作为下一步翻译的模板。
3’
5’
转录的DNA序列
新合成的mRNA
5’
3’
成熟的mRNA
5’
3’
背景知识 - 基因的结构
原核细胞 真核细胞
不同点
相同点
原核细胞 真核细胞
不同点
相同点
原核细胞与真核细胞的基因结构比较：
真核细胞的基因结构比原核细胞的基因结构复杂
编码区是连续的
编码区是间隔的、不连续的
都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成
背景知识 - 基因的结构
基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的筛选与获取
定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
1.目的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
Bt 抗虫蛋白基因；
简称 Bt 基因
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
第一步：目的基因的筛选与获取
2.筛选合适的目的基因
（1）较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2）认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取
（1）PCR的含义
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
（2）PCR的原理：
DNA半保留复制
（3）PCR的场所：
在一定的缓冲溶液中进行，其中一般要添加Mg2＋。
原因？
DNA聚合酶需要Mg2＋激活
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（4）PCR的材料：
DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
C
G
T
A
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A
3'
5'
①解旋：在细胞提供的能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开。
C
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3'
5'
ATP
解旋酶
复习：DNA在体内复制的过程
第一步：目的基因的筛选与获取
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C
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DNA聚合酶
5'
3'
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G
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C
G
A
G
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T
T
5'
3'
dNTP
dNTP
②合成子链：DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以细胞中游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。
复习：DNA在体内复制的过程
第一步：目的基因的筛选与获取
③形成子代DNA分子：每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
C
C
G
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G
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G
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5'
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复习：DNA在体内复制的过程
第一步：目的基因的筛选与获取
第一步：目的基因的筛选与获取
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。
细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物；
细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物。
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。
子链合成需要引物？
第一步：目的基因的筛选与获取
3’
5’
3’
5’
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
①变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA自动解聚为单链。
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
②复性（退火）
不需要解旋酶
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（5）PCR的过程
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
第一步：目的基因的筛选与获取
③延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则延伸合成新的DNA链。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（5）PCR的过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
第一步：目的基因的筛选与获取
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（5）PCR的过程
第一步：目的基因的筛选与获取
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物。
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（5）PCR的过程
第二轮循环的产物
第三轮的产物
①目的基因DNA受热变性后解为单链，
②引物与单链相应互补序列结合；
③然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。
每次循环一般可以分为变性、复性、延伸三步。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（5）PCR的过程
（6）PCR的结果
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
第一步：目的基因的筛选与获取
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能从引物的3′端连接脱氧核苷酸
PCR所用原料实为脱氧核苷三磷酸dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如缓冲液等
3.利用PCR获取和扩增目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取
第一步：目的基因的筛选与获取
思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录为cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：
第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
单链RNA
RNA-DNA杂交双链
单链DNA
双链DNA
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
第一步：目的基因的筛选与获取
拓展：在PCR反应中涉及到的计算问题
1.PCR扩增过程中产生等长的目的基因片段的分析
（1）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过1次循环后产生等长的目的基因片段有 个；经过2次循环后产生等长的目的基因片段有 个；
（2）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过3次循环后产生等长的目的基因片段有 个；
（3）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过4次循环后产生等长的目的基因片段有 个；
（4）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过5次循环后产生等长的目的基因片段有 个；
（5）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过n次循环后产生等长的目的基因片段有 个。
0
0
2
8
22
2n – 2n
拓展：在PCR反应中涉及到的计算问题
练习：图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
（1）图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
（2）图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。
第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生 而失效。
第2组：引物Ⅰ′ 后会出现局部 而失效。
3
碱基互补配对
自身折叠
碱基互补配对
每种引物内部不能发生局部碱基互补配对
两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对
拓展：在PCR反应中涉及到的计算问题
3.如果循环n次，则共需消耗 个引物。
则共需消耗 对引物。
2n－1
2n+1－2
4.两种引物都结合在DNA模板链的 端；
脱氧核苷酸连接在引物的 端进行延伸。
3’
5.设计引物的依据是？
已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。
3’
2.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
第二步：基因表达载体的构建
思考:获得目的基因之后直接转入受体吗？
不是。
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
1.基因表达载体构建的目的
①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因工程的核心工作
一个基因表达载体的组成，除了有目的基因外，还必须有启动子、终止子、标记基因等。
2.基因表达载体的组成
（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
第二步：基因表达载体的构建
2.基因表达载体的组成
③标记基因的作用：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
①启动子：启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类所需的蛋白质。
②终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段，是转录过程终止的信号。
【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，
当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
限制酶切割位点
启动子
标记基因
复制原点
终止子
第二步：基因表达载体的构建
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
补充：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻的碱基
mRNA上三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
③再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
第二步：基因表达载体的构建
3.基因表达载体的构建过程
目的基因
限制酶切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
①首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
②然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
载体
第二步：基因表达载体的构建
请结合下图，回答问题：
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能。
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
第二步：基因表达载体的构建
请结合下图，回答问题：
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能有何弊端？
能
①质粒、目的基因会发生自身环化连接；
②会发生两两自身连接；
③质粒与目的基因会发生反向连接。
第二步：基因表达载体的构建
请结合下图，回答问题：
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
第二步：基因表达载体的构建
总结：1.切割载体和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶应符合什么条件？为什么？
应为同种限制酶或能产生相同末端的限制酶；
产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接；
不一定，载体和目的基因都可能出现自身环化；
三种：载体-载体、目的基因-目的基因、载体-目的基因
2.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，一定会形成重组DNA分子吗？
3.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，可能有几种产物（只考虑两两连接）？
第二步：基因表达载体的构建
4.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，形成的“载体-目的基因”产物一定符合要求吗？
不一定，目的基因可能反向连接到质粒上。
同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体（使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同）。
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。
如何避免上述问题？
5.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
第二步：基因表达载体的构建
练习：图解限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因原则：
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
第二步：基因表达载体的构建
练习：图解限制酶的选择原则
（3）确保出现相同黏性末端原则：
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？
可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（1）花粉管通道法：
我国科学家独创
操作方式：
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
受体细胞为：
受精卵
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法：
“转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，实质是基因重组。
①农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法：
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
c.利用农杆菌进行转化的方法：
将新鲜的从叶片上取下的圆形小叶与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
将花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法：
Ti质粒
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现新性状的植物
植物细胞
染色体DNA
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
第三步：将目的基因导入受体细胞
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
导入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
1.将目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法：
a.两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的 上；
第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞 上。
b.两次导入：
第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入 ；
第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的 导入受体细胞。
T-DNA
染色体DNA
T-DNA
农杆菌
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
——显微注射法
（1）受体细胞：
受精卵
（受精卵容易表现出全能性）
（2）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的转基因动物
第三步：将目的基因导入受体细胞
3.目的基因导入微生物细胞
——Ca2+处理法
（1）受体细胞：
常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。
（2）一般过程：
一般先用Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
再将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
4.将目的基因导入不同细胞的方法
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化 过程
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
第三步：将目的基因导入受体细胞
思考：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时。若无法获得该蛋白，原因可能是什么？如何解决？
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工。
若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
第四步：目的基因的检测与鉴定
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
目的：
1.分子水平的检测
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
PCR等技术
抗原-抗体杂交技术
PCR等技术
①检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质等
第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
基本思路：
制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；
提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
15N
15N
变性
变性
碱基互补配对原则
第四步：目的基因的检测与鉴定
（1）定义：
（2）特点：
①应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。
（3）核酸杂交：
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。
互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
【拓展】基因探针
第四步：目的基因的检测与鉴定
②检测目的基因是否转录出了mRNA
基本思路：
制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；
提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；
高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
1.分子水平的检测
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
碱基互补配对原则
第四步：目的基因的检测与鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
1.分子水平的检测
苏云金杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
抗原抗体的特异性结合
第四步：目的基因的检测与鉴定
2.个体生物学水平的鉴定
类型 检测内容 方法
个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状 或产物是否具有功能活性
抗虫、抗病的接种实验
产品功能活性比较
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
第四步：目的基因的检测与鉴定
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐碱植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未侵染上病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
基因工程的基本操作程序
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获得目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合； PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
2.琼脂糖凝胶电泳
①带电粒子：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
二、材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
PCR仪
电泳装置
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
二、材料用具
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑦PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.PCR加样操作
用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。
（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活）
三、方法步骤
2.离心
盖严离心管，离心10s，使反应液集中在离心管底部。
3.PCR
设置PCR循环程序。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
4.配制琼脂糖溶液：
根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀（琼脂糖用沸水浴或微波炉熔化，稍冷却加入适量核酸染料混匀。 ）。
5.制备凝胶
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
电泳缓冲液用来维持pH值，使DNA带负电荷。
三、方法步骤
梳子孔为加样孔
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
6.加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（ Maker ）。
7.电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
三、方法步骤
8.观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
四、操作提示
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
探究实践 - DNA片段的扩增及电泳鉴定
五、结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
练习与应用
一、概念检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。 （ ）
（2）构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
练习与应用
二、拓展应用
研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。

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