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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
二 动物细胞融合技术与单克隆抗体
复习回顾 - 植物体细胞杂交技术
A细胞
B细胞
A原生质体
B原生质体
正在融合的原生质体
杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
移栽后的植株
①
①
②
③
④
⑤
⑥
那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？
植物体细胞杂交技术的优势：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育了植物新品种。
复习回顾 - 人——鼠细胞荧光标记融合实验
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
该实验说明：
细胞膜具有流动性
一、动物细胞融合技术
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞
细胞膜的流动性
1.概念：
4.结果：
2.原理：
3.诱导方式
物理法：离心、振动、电激
化学法：聚乙二醇（PEG)
生物法：灭活的病毒
动物细胞融合特有
一、动物细胞融合技术
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
灭活病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合实质及完成的标志：
细胞核的融合
灭活病毒诱导细胞融合的原理
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
一、动物细胞融合技术
4.意义：
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
5.应用：
（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
至今，种间、属间、科间，甚至动植物之间融合都已获得了成功。
生物种类 细胞来源 成功年代
酵母菌—鸡 原生质体—血红细胞 1975年
人—胡萝卜 腹水癌细胞—原生质体 1976年
人—小鼠 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 1978年
比较植物体细胞杂交与动物细胞融合技术
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
步骤
诱导方法
结果
意义
细胞膜的流动性和植物细胞的全能性
细胞膜的流动性、细胞增殖
酶解法去掉细胞壁后，诱导原生质体融合，形成杂种体细胞，
再经过植物组织培养形成杂种植株
分散成单个细胞后诱导细胞融合
物理方法、化学方法、灭活病毒
形成杂种植株
形成杂种细胞
克服远缘杂交不亲和障碍
物理方法、化学方法
二、单克隆抗体及其应用
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
1.早期获得抗体的方法：
产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏
反复
注射
动物体内
抗原
多种浆细胞
多种抗体（血清）
每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体
体内产生的特异性抗体多达百万种
缺点：
二、单克隆抗体及其应用
2.单克隆抗体的制备思路
（1）B淋巴细胞特点：
①哺乳动物感染病原体后，体内会形成相应的B淋巴细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。
②动物体内产生的特异性抗体种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
③要想获得大量单一抗体，必须克隆（大量增殖）单一的B淋巴细胞，形成细胞群。
④面临困难：在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。
实质是浆细胞
二、单克隆抗体及其应用
（2）骨髓瘤细胞特点：
在体外培养条件下，能大量增殖。
一种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
（能产生抗体）
（能大量增殖）
融合细胞
（既能产生抗体，又能大量增殖）
杂交瘤细胞
既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。
单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，由这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
2.单克隆抗体的制备思路
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
二、单克隆抗体及其应用
3.单克隆抗体的制备过程
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
注射特定的抗原
从脾中提取
诱导融合
能产生抗体，但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
（1）用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
二、单克隆抗体及其应用
3.单克隆抗体的制备过程
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)
若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？
B-B细胞
B-瘤细胞
瘤-瘤细胞
3种
第一次筛选
（2）用特定的选择培养基（HAT培养基）进行筛选：
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
资料卡：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死。
培养基中加入氨基蝶呤
二、单克隆抗体及其应用
3.单克隆抗体的制备过程
（3）对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞
①将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养（克隆化培养）；
②一段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）；
③阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
检测方法：抗原—抗体杂交技术
二、单克隆抗体及其应用
多孔细胞培养板
阳性克隆的筛选和克隆化培养
用培养液有限稀释
克隆化培养与抗体检测
二、单克隆抗体及其应用
（4）将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。
（5）从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔内
细胞培养液提取
小鼠腹水中提取
单克隆抗体
特异性强，
灵敏度高，
可大量制备
3.单克隆抗体的制备过程
二、单克隆抗体及其应用
4.单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因
目的
筛选 方法
筛选出杂交瘤细胞
筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
二、单克隆抗体及其应用
二、单克隆抗体及其应用
应用到的技术：
原理：
细胞膜的流动性
多种杂交细胞及未融合的细胞
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
提取
杂交瘤细胞
第一次筛选：用特定的选择性培养基
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔
大量单克隆抗体
第二次筛选：克隆化培养、抗体检测
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
动物细胞融合
动物细胞培养
细胞增殖
单克隆抗体制备过程
二、单克隆抗体及其应用
思考 讨论
单克隆抗体的应用
【资料1】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
二、单克隆抗体及其应用
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
【资料2】使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates, ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。
思考 讨论
单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
讨论1. ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
思考 讨论
单克隆抗体的应用
讨论2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
二、单克隆抗体及其应用
讨论3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；
生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
思考 讨论
单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
5.单克隆抗体的优点
（1）能准确地识别抗原的细微差异；
（2）与特定抗原发生特异性结合；
（3）可以大量制备。
6．单克隆抗体的应用
（1）广泛用作诊断试剂
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
（2）运载药物：
如抗体-药物偶联物（ADC）。
生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤。
(单抗导向，药物为弹头)
优点：位置准确、疗效高、副作用小
（3）直接用于治疗疾病。
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
三、练习与应用
C
A

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