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高等教育出版社
农业生物技术
项目3 植物组织培养基础
项目目录
项目导入
任务3.1 植物组织培养技术原理与应用概述
任务3.2 植物组织培养实验室的结构、仪器 设备和用具
任务3.3 消毒与灭菌
任务3.4 培养基配制
项目目录
项目导入
学生物的小李非常喜欢植物，最近他在野外看到一种颜色和香味非常独特的植物，经多方查询，市场上没有。于是他萌发了一个想法，就是把这种植物推向市场。可是该植株正值营养生长期，无法采摘其种子。小李决定自学植物组织培养技术，以实现植株短时间内大量扩繁，于是他凭借自身的生物学功底，查询植物组织培养的相关技术，了解组培企业生产现状，并筹资搭建小型实验室、租赁了一块地供扩繁用。
任务3.1 植物组织培养技术原理与应用概述
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.掌握植物组织培养的相关概念。
2.掌握植物组织培养的类型、特点。
3.了解植物组织培养在农业方面的应用。
4.了解组培企业的工作制度。
5.了解组培企业的生产岗位设置和工作职责。
1.能利用信息化资源了解植物组培技术的发展现状与应用前景。
2.能通过小组合作进行组培企业调查，了解岗位设置情况。
任务目标
一、植物组织培养的相关概念
二、植物组织培养的原理
三、植物组织培养的类型
四、植物组织培养的特点
五、植物组织培养的应用
六、组培企业中的岗位设置及其相应职责
任务准备
一.植物组织培养的相关概念
1.植物组织培养
在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的过程。
一.植物组织培养的相关概念
2.植物组织快繁技术
利用植物组织培养技术，快速繁殖‘名、优、特、新、稀’等植物品种，使其在短时间内繁衍大量植株的一套技术与方法。
又称离体快繁技术、试管快繁技术。
一.植物组织培养的相关概念
3.外植体
在植物组织培养过程中，由植物体上切取的根、茎、叶、花、果实、种子及被培养的部分组织统称为外植体。
一、植物组织培养的相关概念
4.组培苗
是指以植物的器官、组织、细胞等为材料，在无菌条件下接种培养而成的小苗。
二、植物组织培养的原理
1.植物细胞全能性
是指植物体上每个具有完整细胞核的植物细胞，都具有该植物体的全部遗传信息和产生完整植株的能力。
二、植物组织培养的原理
2.细胞的分化和形态建成
通常情况下，性细胞结合成合子，合子进一步发育成胚。构成胚的所有细胞几乎都保持着未分化的状态和旺盛的细胞分裂能力，称为胚性细胞，或分生性细胞。
二、植物组织培养的原理
2.细胞的分化和形态建成
已分化的细胞恢复分裂转变为分生性状态，并形成愈伤组织的过程称为脱分化。
愈伤组织是指在人工培养基上通过诱导外植体而形成的一团无序生长的薄壁细胞团。
二、植物组织培养的原理
2.细胞的分化和形态建成
由脱分化的愈伤组织细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，形成一个完整的植物体或植物器官的现象称为再分化。
一个已分化细胞要表达出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组织培养所要达到的目的。
二、植物组织培养的原理
3.植物的再生功能
是指植物体因受伤或生理上分离而失掉组织或器官后，恢复或复制失去部分，形成新的完整植株的能力。
三、植物组织培养的类型
1.培养对象
器官培养
组织培养
植株培养
细胞培养
原生质体培养
三、植物组织培养的类型
2.培养方式
液体培养
固体培养
三、植物组织培养的类型
3.培养过程
继代培养
初代培养
三、植物组织培养的类型
4.培养条件
暗培养
光培养
四、植物组织培养的特点
1.研究材料来源单一，遗传信息高度一致
2.取材经济，管理方便，工作效率高
3.培养条件人为控制，可周年连续进行生产或试验
4.生长快，周期短，繁殖率高
五、植物组织培养的应用
1.优良品种的快速繁殖
从1个植物茎尖开始，经组织培养1年内可培育出几万到几百万株幼苗。
五、植物组织培养的应用
2.脱毒及脱毒苗的再繁育
通过微茎尖的离体培养可有效地去除植物体内的病毒，获得无病毒种苗。
五、植物组织培养的应用
3.植物新品种的培育
植物组织培养技术为育种提供了现代的技术手段，解决了育种周期长、技术繁琐、短期不见效果的问题。
五、植物组织培养的应用
4.种质资源的保存和交换
目前植物种质资源的保存有两个问题：
遗传资源日趋衰竭，造成有益基因逐渐丧失；
田间保存耗资大，易受损失。
五、植物组织培养的应用
5.有用次生代谢产物的生产
提取人类需要的多种天然有机化合物。
这些化合物虽是高等植物的次生代谢产物，但产生量极其有限，有些还不能人工合成，所以远远不能满足社会需求。
六、 组培企业中的岗位设置及其相应职责
1.培养基制备工：配制母液和工作培养基
2.接种工：进行外植体接种和继代、生根转接。
3.培养工：负责培养车间的管理。
4.驯化移栽与养护工：负责组培苗的驯化移栽和日常养护工作。
参观当地组培企业
一、目的与要求
二、内容与安排
三、方法与步骤
四、实训报告
任务实施
通过参观当地组培企业，了解组培企业生产岗位设置情况、工作制度等。
一、目的与要求
。
分组进行实践（每组4-6人），集体参观组培企业，听取企业专家的讲解。
二、内容与安排
。
1.指导教师集中讲解本次实训的目的、要求及内容，以及有关注意事项。
2.指导教师根据班级人数，进行分批，并布置参观任务。
三、方法与步骤
。
3.学生分组按照植物组织培养的生产工艺流程参观组培企业，企业专家介绍有关企业规章制度，生产岗位设置情况，岗位工作职责等。
4.学生分组汇报各企业组培岗位设置情况、各岗位工作职责等。
三、方法与步骤
教师对各小组任务完成情况进行点评，并解答学生对本次实训的疑问。
各小组对任务完成情况进行互评，指出优点和不足，并完成调查报告，调查报告内容包括：企业位置，企业名称，企业制度，生产岗位，岗位职责，组培苗品种等。
四、实训报告
1.什么是外植体？什么是组培苗？
2.简述植物组织培养的原理。
3.简述植物组织培养的特点。
任务反思
任务3.2 植物组织培养实验室的结构、仪器设备和用具
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.了解组培室的基本结构。
2.掌握植物组织培养实验室各部分的功能及设计要求。
3.掌握植物组织培养相关设备、用具的使用方法及注意事项。
1.能对现有植物组织培养实验室的设计进行合理评估，并提出修改意见。
2.能规范使用植物组织培养实验室的设备、用具。
任务目标
一、植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
二、仪器设备和用具
任务准备
一、植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
植物组织培养工艺流程
一、植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
（一）药品配制室
1.功能：主要用于化学药品的储藏、称量和溶液的配制。
2.设计要求
3.仪器与用具配置
一、植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
（二）洗涤室
1.功能：洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存；
外植体的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗与整理等工作。
2.设计要求
3.仪器与用具配置：水槽、晾干台、周转箱、烘箱等。
一、植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
（三）培养基制作室
1.功能：主要负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。
2.设计要求
3.仪器与用具配置：托盘天平、酸度计、工作台、高压灭菌锅、
周转箱、储物柜等。
一、植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
（四）缓冲间
1.功能：防止工作人员进出时带进杂菌。
2.设计要求
3.仪器与用具配置：紫外灯、鞋柜、衣柜等。
一.植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
（五）接种室
1.功能：进行植物材料的分离接种及培养物转移。
2.设计要求
3.仪器与用具配置：超净工作台、紫外灯、空调机、医用小推车、接种器具消毒器、酒精灯、 接种工具、搁物架等。
一.植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
（六）组培苗培养室
1.功能：供接种后材料的培养。
2.设计要求
3.仪器与用具配置：培养架、空调机、光照时控器、温度计、摇床等。
一.植物组织培养实验室的结构及其功能、设计要求
（七）组培苗驯化移栽室
1.功能：进行组培苗的驯化和移栽。
2.设计要求
3.仪器与用具配置：移栽容器、弥雾装置、遮阳网、移栽基质等。
二、仪器设备和用具
（一）灭菌设备
1.湿热灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅）
二、仪器设备和用具
（一）灭菌设备
2.过滤灭菌设备（防细菌滤膜）
二、仪器设备和用具
（一）灭菌设备
3.干热灭菌设备
二、仪器设备和用具
（一）灭菌设备
4.其他灭菌设备
二、仪器设备和用具
（二）接种设备与用具
1.超净工作台
二.仪器设备和用具
（二）接种设备与用具
2.接种工具
二.仪器设备和用具
（二）接种设备与用具
3.显微镜
二.仪器设备和用具
（三）培养设备与用具
1.培养架
二.仪器设备和用具
（三）培养设备与用具
2.恒温振荡器
二、仪器设备和用具
（三）培养设备与用具
3.光照培养箱
二、仪器设备和用具
（三）培养设备与用具
4.培养器皿
二、仪器设备和用具
（四）称量设备与用具
1.天平
二、仪器设备和用具
（四）称量设备与用具
2.烧杯
二、仪器设备和用具
（四）称量设备与用具
3.量筒
二、仪器设备和用具
（四）称量设备与用具
4.试剂瓶
二、仪器设备和用具
（四）称量设备与用具
5.吸量管
二、仪器设备和用具
（四）称量设备与用具
6.容量瓶
二、仪器设备和用具
（五）环境控制设备与用具
1.空调机
二、仪器设备和用具
（五）环境控制设备与用具
2.冰箱
二、仪器设备和用具
（五）环境控制设备与用具
3.光照时控器
二、仪器设备和用具
（六）其他设备与用具
1.磁力搅拌器
二、仪器设备和用具
（六）其他设备与用具
2.蒸馏水发生器或纯水机
纯水机
二、仪器设备和用具
（六）其他设备与用具
3.药品柜
二、仪器设备和用具
（六）其他设备与用具
4.加热设备
包括液化气灶、电炉、恒温水浴锅等
二、仪器设备和用具
（六）其他设备与用具
5.pH计
二、仪器设备和用具
（六）其他设备与用具
一、参观组培室
二、组培室的设计训练
任务实施
（一）目的与要求
通过参观组培实训室，掌握植物组织培养实验室的基本规划和布局设计要求，了解如何组建组培室，熟悉组织培养中涉及的各种仪器设备和器皿用具。
一、参观组培室
。
（二）方法与步骤
1.集中学习组织培养实验室守则及有关注意事项。
2.指导教师讲解植物组织培养的流程。
3.分组了解组培实验室的构建情况，包括准备室、缓冲间、无菌操作室（又称接种室）和培养室的设计要求。
4.分组学习仪器设备的名称、用途、使用方法及注意事项。
5.指导教师讲解组培实验室中常用的参数，如灭菌温度和时间、培养室的温度、光照时数、光照强度等。
一、参观组培室
。
（三）实训报告
1.绘出植物组织培养实验室的布局。
2.各写出5种主要设备、用具的用途。
一、参观组培室
。
（一）目的与要求
通过对组培室的设计，掌握植物组织培养实验室的设计原则和总体要求，掌握各功能室的布局，以及必备的设施设备，能够根据需要和实际情况科学设计组培室。
二、组培室的设计训练
。
（二）内容与安排
指导教师介绍待建设组培室面积及建设基本要求。
学生分组讨论组培室的设计方法与注意事项，并结合实验室面积和实际情况进行合理规划。
二、组培室的设计训练
。
（三）方法与步骤
1.学生分组进行组培实验室的设计。
2.指导教师对学生的分区进行点评。
3.学生通过查询网络资源，了解最新的组培仪器设备的功能，并在图纸上绘制出各仪器设备的摆放位置，分组提交组培室平面设计图，教师点评。
4.小组间进行互评，并通过小组PK，选出最佳组培实验室设计方案。
二、组培室的设计训练
。
（四）实训报告
1.将本次内容整理成实训报告。
2.对每组构思的植物组织培养实训室组建方案进行评价。
二、组培室的设计训练
。
1.组培室包括哪些功能室？
2.在设计缓冲间、接种室、培养室时如何避免空气对流？
3.如何合理布置灭菌室与接种室之间的传递窗？
4.目前组培企业常用的仪器设备的功能和使用方法是什么？
5.如何因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建组培实验室？
任务反思
任务3.3 消毒与灭菌
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.了解常用的消毒灭菌方法。
2.重点掌握超净工作台、培养基、接种工具的灭菌方法。
3.了解和掌握外植体表面灭菌方法。
1.能根据具体的培养材料，设计实验，对外植体进行表面灭菌操作。
2.能正确进行培养环境的消毒。
任务目标
一、洗涤技术
二、灭菌与消毒技术
三、组培室的灭菌
任务准备
一、洗涤技术
（一）洗涤液
1.肥皂、洗衣粉、洗洁精
2.铬酸洗涤液
一、洗涤技术
（二）各类器皿和用具的洗涤方法
1.新的玻璃器皿
2.已用过的培养器皿
3.已被霉菌等杂菌污染的器皿
4.移液管、量筒等量器
5.载玻片和盖玻片
6.解剖刀、镊子、剪刀等
二、灭菌与消毒技术
（一）灭菌与消毒的区别
1.有菌和无菌的范畴
2.灭菌与消毒的区别
二、灭菌与消毒技术
（二）常用的灭菌方法
三、组培室的灭菌
（一）环境灭菌
1.空气过滤灭菌
2.紫外线照射灭菌
3.喷雾灭菌
4.熏蒸灭菌
三、组培室的灭菌
（二）用具灭菌
1.干热灭菌
2.湿热灭菌
3.浸泡灭菌
4.擦拭灭菌
三、组培室的灭菌
（三）培养基灭菌
1.湿热灭菌
2.过滤灭菌
液体过滤灭菌装置
三、组培室的灭菌
（四）外植体灭菌
消毒剂 使用浓度% 去除难易程度 消毒时间min 灭菌效果
次氯酸钙 9～10 易 5～30 很好
次氯酸钠 2 易 5～30 很好
漂白粉 饱和溶液 易 5～30 很好
溴水 1～2 易 2～10 很好
过氧化氢 10～12 最易 5～15 好
升汞 0.1～1 较难 2～10 最好
酒精 70～75 易 0.2～2 好
抗生素 4～5（mg/L） 中 30～60 较好
硝酸银 1 较难 5～30 好
常用灭菌剂的使用和效果
各种器具的洗涤训练
一、目的与要求
二、仪器与用具
三、方法与步骤
四、注意事项
五、评价与考核
任务实施
掌握洗涤液的配置方法，掌握组织培养常用实验器皿及器械的洗涤方法。
一、目的与要求
。
1.仪器用具：烘箱、高压蒸汽灭菌锅、容量瓶，玻璃棒、量筒、烧杯，组培瓶，培养皿，手套、试管刷等。
2.试剂：重铬酸钾、浓硫酸、盐酸、四氯化碳、酒精、蒸馏水、洗衣粉、肥皂、洗洁精等。
二、仪器与用具
。
（一）铬酸洗液的配制
（二） 1％盐酸的配制
（三）各种器皿的洗涤
三、方法与步骤
。
(一)使用铬酸洗涤液要戴橡胶手套操作。
(二)特别注意要清洗干净器皿口及四周，不留任何残迹。
(三)培养器皿上的标记一定要擦干净。
(四)洗过的玻璃器皿要晾干或烘干后才能使用。
(五)瓶盖内部要刷洗干净。
四、注意事项
。
各种器具的洗涤训练评价与考核标准参照表3-2执行。
五、评价与考核
。
1.为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？
2.各类器皿分别使用什么方法进行洗涤，洗涤时应注意哪些事项？
任务反思
任务3.4 培养基配制
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.了解培养基的组成成分及作用。
2.掌握常用培养基的种类及特点。
3.明确培养基母液配制的目的和意义。
1.能按照配方熟练规范地完成各类培养基母液的配制。
2.能正确进行培养基母液的保存。
3.能根据配方独立进行培养基母液的量取、培养基的配制与分装。
4.会规范使用高压蒸汽灭菌锅对培养基进行灭菌，并能正确存放。
任务目标
一、培养基的组成
二、培养基的种类
三、常用培养基的配方和特点
四、培养基母液的配制
五、工作培养基的配制
任务准备
一、培养基的组成
培养基主要有水、无机盐、有机物、植物生长调节物质、培养基的支持材料五大类组成。
一、培养基的组成
（一）水
选用蒸馏水
有利于减少发霉变质
延长培养基母液的贮藏时间
大规模生产时，配制培养基可用自来水代替蒸馏水
一、培养基的组成
（二）无机盐
大量元素（浓度大于0.5 mmol/L）
微量元素（浓度小于0.5 mmol/L）
一、培养基的组成
（三）有机物
糖类
维生素类
肌醇
氨基酸
天然有机复合物
一、培养基的组成
（四）植物生长调节物质
1.生长素类
种类：IAA（吲哚乙酸）、IBA （吲哚丁酸）、 NAA、 2，4-D
生理作用：
诱导愈伤组织的形成
促进根的生长
协助细胞分裂素促进细胞分裂和伸长
一、培养基的组成
（四）植物生长调节物质
2.细胞分裂素类
种类：6-苄基腺嘌呤（6-BA ）、激动素（KT）、玉米素（ZT）
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：
①诱导芽的分化，解除顶端优势，促进侧芽萌发。
②促进细胞分裂。
③抑制根的分化。
一、培养基的组成
（四）植物生长调节物质
3.赤霉素（GA）
生理作用：
刺激不定胚发育成小植株
促进幼苗茎的伸长生长
促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发
打破休眠
与生长素协同作用，对形成层的分化有影响
一、培养基的组成
（五）培养基的其他成分
1.琼脂
作用：固化剂，起支持作用
用量：6 g/L-10g/L
凝固能力与生产原料、工艺、培养温度、高温灭菌条件有关
PH值的影响，过酸、过碱均不凝固
色浅、透明、洁净为好
一、培养基的组成
（五）培养基的其他成分
2.抗生物质
作用：防止菌类污染
种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等
用量：5-20 mg/L
一、培养基的组成
（五）培养基的其他成分
3.抗氧化物
培养基中添加抗氧化物是为了抑制外植体和培养物褐变。常用的抗氧化剂有半胱氨酸、维生素C、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。
一、培养基的组成
（五）培养基的其他成分
4.活性炭
活性炭有很强的吸附作用，它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚类、醌类物质及激素等。通常使用浓度为0.1～10g/L。
二、 培养基的种类
培 养 基 种 类
固体培养基：在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态。
根据形态
液体培养基：培养基中没有凝固剂为液体状态。
根据培养阶段
根据培养进程
根据营养水平
初代培养基：初代培养阶段所用的培养基。
继代培养基：继代培养阶段所用的培养基。
完全培养基：在基本培养基中加入适宜的植物激素和有机附加物的培养基。
基本培养基：只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合成培养基。如Ms、White、Nitsch、N6等培养基。
诱导培养基：初代培养时诱导外植体生长与脱分化的培养基。
增殖培养基：继代培养中促进培养物快速增殖的培养基，也称扩繁培养基。
生根培养基：诱导试管苗生根的培养基。
培养基的种类
三、常用培养基的配方和特点
目前已公开报道的基本培养基有许多种类，各有不同的特点和适用范围，在植物组织培养生产中应根据不同的植物种类和培养部位及不同的培养目的选用不同的培养基。
四、培养基母液的配制
（一）母液的配制方法
1.单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。
2.混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起,定容到一定体积,配成混合母液。
四、培养基母液的配制
（二）母液配制要求
1.母液浓缩
2.防止沉淀
3.激素母液浓度
四、培养基母液的配制
（三）药品用量的计算
配制母液时药品用量（mg）=配方用量（mg/L）×浓缩倍数×制备体积（L）
配制激素母液时药品用量（mg）=激素母液浓度（mg/mL）×制备体积（mL）
四、培养基母液的配制
（四）培养基母液配制流程
四、培养基母液的配制
（四）培养基母液配制流程
四、培养基母液的配制
（五）工作培养基的配制
1.工作培养基的配制流程图
四、培养基母液的配制
（五）工作培养基的配制
2.工作培养基配制的部分操作实景
四、培养基母液的配制
（五）工作培养基的配制
3.培养基的存放
防尘
恒温
定期更新
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
二、MS固体培养基母液的配制与灭菌技能实训
任务实施
（一）目的与要求
通过MS培养基母液的配制，掌握培养基母液配制的基本技能，掌握各种母液的保存方法。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（二）仪器用具与试剂
1.仪器设备：电子分析天平、电子天平、电炉等。
2.材料用具：药匙、玻璃棒、称量纸、量筒、移液管等。
3.试剂：MS培养基各成分试剂、95%酒精、1mol/L NaOH、1mol/L HCl，植物生长调节剂（如2，4-D、6-BA、NAA）等。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（三）方法与步骤
（1）MS培养基母液配制
1.大量元素母液：配成浓缩10倍的母液。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（三）方法与步骤
（1）MS培养基母液配制
2.微量元素母液：配成浓缩100倍的母液。用感量0.0001g分析天平按表2-3准确称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000mL。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（三）方法与步骤
（1）MS培养基母液配制
3.铁盐母液：配成浓缩100倍的母液，用感量0.01g电子天平按表2-3称取药品，分别溶解，混合后加水定容至1000mL。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（三）方法与步骤
（1）MS培养基母液配制
4.有机物母液：配成浓缩100倍的母液。用感量0.001g分析天平按表2-3分别称取药品，溶解，混合后加水定容至1000mL。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（三）方法与步骤
（1）MS培养基母液配制
5.激素母液：每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成0.1～1.0mg/mL，用时根据需要取用。多数激素难溶于水，要先溶于特定溶剂，然后才能加水定容。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
MS培养基母液的各成分比例
（三）方法与步骤
（2）MS培养基母液保存
将配制好的母液分别倒入试剂瓶中，贴好标签，在标签上注明母液名称，配制倍数（或浓度），配制人，配制日期。
然后放入冰箱内4℃低温保存，用时再按比例稀释。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（四）培养基母液配制时注意的问题
在培养基母液配制过程中，如果CaCl2·2H2O没有完全溶解，会导致大量元素母液产生浑浊或沉淀。
要特别注意各类母液标签的书写，尤其是激素母液，浓度单位为mg/mL。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（五）评价与考核
学生分小组合作完成培养基母液的配制，依据母液配制的标准进行全过程评价，MS培养基母液的配制与保存评价与考核标准参照表3-6执行。
一、MS培养基母液的配制与保存技能实训
。
（一）目的与要求
通过MS固体培养基的配制，学习培养基配制与灭菌的方法。
二、MS固体培养基的配制与灭菌技能实训
。
（二）仪器用具与试剂
1.仪器用具：药匙、玻璃棒、称量纸、胶头滴管、洗瓶、标签纸、烧杯、量筒、移液管或移液枪、洗耳球、组培瓶、pH试纸或pH计、电子天平、电磁炉、高压灭菌锅等。
2.试剂：1mol/L NaOH、1mol/L HCl、MS培养基各种母液、各类激素母液（2，4-D、6-BA、IAA、NAA）、琼脂、蔗糖、蒸馏水等。
二、MS固体培养基的配制与灭菌技能实训
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（1）确定培养基配方及用量
根据培养对象、培养目的等，通过查阅资料及咨询等确定培养基配方，然后据接种数量和试验处理的多少确定培养基的用量。
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（2）计算各种母液用量：
母液取用量（mL）=配制培养基的体积（mL）÷浓缩倍数
生长调节物质母液取用量（mL）=培养基配方中的浓度（mg/L)×配制培养基体积（L）÷母液浓度（mg/mL)
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（3）称取琼脂、蔗糖
用电子天平分别称取蔗糖30g，琼脂7g。
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（4）量取母液
根据计算出的母液用量，按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、植物激素的顺序依次将母液取出，混合。
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（5）培养基熬制
量取600mL蒸馏水放入加热容器中（注意蒸馏水的体积应少于所配制培养基体积，约占终体积的2/3-3/4），加入称量好的琼脂和蔗糖，接通电源加热。边加热边搅拌，防止糊底和溢出，至完全溶化。
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（6）定容
将母液混合液加入到琼脂完全溶化的培养基中，搅拌混匀，并加水定容到所需体积。
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（7）调节pH
用酸度计或精密pH试纸测试培养基溶液的pH值(5.8)，偏碱滴加0.1mol/L的HCl调整，偏酸滴加0.1mol/L的NaOH调整，直到达到配方要求值。
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（8）分装
用乳胶管把配制好的培养基趁热分装到培养瓶中，100～150mL的培养瓶每瓶装入30～35mL左右的培养基，分装时数量要均匀、合适，培养基不沾附瓶口和瓶壁。
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（9）封口
用合适的封口材料或线绳包扎。
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（三）方法与步骤
1.培养基的配制与分装
（10）标识与记录
封装好的培养基做好标记放到高压灭菌锅中准备灭菌。
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（三）方法与步骤
2.培养基的灭菌
（1）使用前应仔细阅读说明书，严格按要求操作。
（2）先在高压蒸汽灭菌锅内加纯水，加水量应按照说明上的要求，没过加热管。
（3）不可装得太满，否则因压力与温度不对应，造成灭菌不彻底。
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（三）方法与步骤
2.培养基的灭菌
（4）通常灭菌要求1.1kgf/cm2，锅内达121℃，按不同灭菌要求维持压力15-40min。
（5）不能随意延长灭菌时间和增加压力。培养基要求比较平格，既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中成分变质或效力降低，琼脂在长时间灭菌后凝固力也会下降，以致不凝固。
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（三）方法与步骤
2.培养基的灭菌
（6）灭菌结束后，务必缓慢放出蒸汽，才不使压力降低太快，以免引起激烈的减压沸腾，容器中的液体四溢，培养基玷污棉塞、瓶口等造成污染。当压力逐渐降至零后，才能打开盖子。
（7）含吲哚乙酸或赤霉素的培养基，要在配制后的1周内使用完，其他培养基最多也不应超过1个月。
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（四）培养基配制、分装和灭菌时注意的问题
1.培养基熬制时边煮边搅拌，防止糊底。用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。
2.配制培养基一定按母液顺序依次加入。
3.熬制培养基过程中，先放入难溶解的琼脂及有机附加物，最后加入药剂混合液，因混合液中的有机物遇热时间长易分解失效。
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（四）培养基配制、分装和灭菌时注意的问题
4.多数植物适宜的pH值在5.6～6.5，而培养基经高压灭菌pH值一般会降低0.2～0.3个单位，故调节pH值时应比选定pH值提高0.2～0.3个单位。
5.分装培养基时，注意不能将培养基溶液喷洒到瓶壁口处，容易落菌污染。
二、MS固体培养基的配制与灭菌技能实训
（四）培养基配制、分装和灭菌时注意的问题
1.培养基熬制时边煮边搅拌，防止糊底。用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。
2.配制培养基一定按母液顺序依次加入。
3.熬制培养基过程中，先放入难溶解的琼脂及有机附加物（马铃薯、香蕉等），最后加入药剂混合液，因混合液中的有机物遇热时间长易分解失效。
4.多数植物适宜的pH值在5.6～6.5，而培养基经高压灭菌pH值一般会降低0.2～0.3个单位，故调节pH值时应比选定pH值提高0.2～0.3个单位。
5.分装培养基时，注意不能将培养基溶液喷洒到瓶壁口处，容易落菌污染。
6.灭菌过程中须完全排除锅内冷水汽，使锅内全部是热水蒸汽，灭菌才能彻底。
7.培养基灭菌严格按要求时间进行，如超过时间，培养基成分发生变化易失效。
8.培养基灭菌后，立即取出摆平冷却。取出过晚凝固差，影响接种转苗质量。
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（四）培养基配制、分装和灭菌时注意的问题
6.灭菌过程中须完全排除锅内冷水汽，使锅内全部是热水蒸汽，灭菌才能彻底。
7.培养基灭菌严格按要求时间进行，如超过时间，培养基成分发生变化易失效。
8.培养基灭菌后，立即取出摆平冷却。取出过晚凝固差，影响接种转苗质量。
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（五）评价与考核
学生分小组合作完成培养基的配制，并汇报任务完成情况，观察在配制培养基过程中的现象与遇到的问题，并加以解释。教师对学生进行全过程评价，评价与考核标准参照表3-7执行。
二、MS固体培养基的配制与灭菌技能实训
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1.给出扩大倍数和体积，让学生分别写出母液配制方法步骤。
2.配制培养基母液时应注意哪些事项？
3.如何根据培养基配方和体积进行培养基的配制？
4.培养基为什么要调pH？
5.高压灭菌时应注意哪些事项？
任务反思
谢谢聆听！

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