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(共110张PPT)
高等教育出版社
农业生物技术
项目4 植物组织培养快速繁殖技术
项目目录
项目导入
任务4.1 初代培养
任务4.2 继代培养
任务4.3 壮苗与生根培养
任务4.4 驯化移栽与苗期管理
项目目录
项目导入
小刘想从事某种果树的组织培养快速繁殖研究，前期他已经建好组培实验室，仪器设备也准备完毕，接下来就是如何进行该果树的植物组培快繁。那植物组培快繁具体包括哪些流程呢？每一个流程又是如何操作的
任务4.1 初代培养
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.了解外植体的成苗途径。
2.掌握外植体选择的原则和预处理方法。
1.能根据培养的植物种类选择合适的外植体并进行正确的预处理。
2.能熟练、规范地对外植体进行消毒和接种。
任务目标
一、初代培养的概念
二、外植体的成苗途径
三、外植体的选择
四、外植体的处理与接种
五、培养
任务准备
一、初代培养的概念
初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。
二、外植体的成苗途径
（一）顶芽和腋芽的成苗
（二）不定芽的成苗
（三）体细胞胚状体的成苗
（四）原球茎的发育
三、外植体的选择
理论上讲，植物的任何活器官、细胞或组织都能作外植体。但不同种类植物、不同组织和器官对诱导条件的反应往往是不一致的，外植体选择的合适与否决定着组织培养的难易程度。
（一）外植体选择的原则
1.选择优良的种质
2.选择幼嫩的、生理状态良好的材料
3.选择生长旺盛、再生能力强的材料
4.选择来源丰富的材料
5.选择合适的外植体大小
（二）外植体的选择部位
木本植物、能形成茎段的草本植物以采取茎尖和茎段比较适宜，能在培养基的诱导下萌发出侧芽，成为中间繁殖体。
有些草本植物植株短小或没有显著的茎，可用叶片、叶柄、花萼、花瓣作外植体。
四、外植体的处理与接种
（一）外植体的预处理
1．根与地下组织器官
剪除老根、烂根；切除损伤和污染严重的部位。
用软毛刷清除泥土、虫卵等物。
2．茎尖与茎段
削除或剪除枝条上的叶片、刺、卷须等附属物，软质枝条用软毛刷蘸肥皂水或洗涤液刷洗，硬质枝条可用刀刮除枝条表面的蜡质、茸毛等。枝条可剪成长4-5 cm，带2-3个腋芽的茎段。
3．叶片
一般叶片表面有覆盖有油脂、蜡质、茸毛等，可用软毛刷蘸肥皂水或洗涤液刷洗，较大的叶片可剪成若干带叶脉的叶块，其大小以方便放入冲洗容器中冲洗即可。
4．花器
花器一般较干净，不用修整即可直接冲洗消毒。
5．果实、种子、胚和胚乳
对于种皮密度较大、透性较差和种子可先去种皮或用低浓度的盐酸浸泡或用机械打磨，再进行进一步的消毒。
（二）外植体的表面灭菌与接种
五、培养
组培所需的条件包括：温度、湿度、光照；培养基组成、pH值、渗透压等各种环境条件。
这些环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。
1．温度
大多数植物组织培养都在23-27℃之间进行，一般采用（25土2）℃。
温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。
2．光照
主要表现在光强和光照时间（光周期）方面。
光照强度：2000-3000 lx
光照时间：连续16h光照、8h黑暗
3．湿度
影响组织培养的湿度包括以下两个方面：培养容器内的湿度和培养室内环境的湿度。
一般要求培养室内要保持70％～80％的相对湿度。
4．培养基的pH值
大多数植物适宜的pH值在5.6～6.5之间，一般培养基皆要求5.8。
如果pH值不适则直接影响外植体对营养物质的吸收，进而影响其分化、增殖和器官的形成。
5．渗透压
培养基中由于有无机盐类、蔗糖等化合物，因此，会影响渗透压的变化。
通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。
6．气体
氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。
固体培养基可加入活性炭来增加通气度，以利于发根。
接种时应避免把外植体全部埋入培养基中，以免造成缺氧。
月季外植体的消毒与接种实训
一、目的与要求
二、仪器用具与试剂
三、方法与步骤
四、注意事项
五、观察记录
六、评价与考核
任务实施
掌握月季外植体的选择、清洗、消毒、切割、接种等操作技术；通过无菌操作训练，掌握植物组织培养中的无菌操作技术。
一、目的与要求
。
1、仪器用具
2、试剂
二、仪器用具与试剂
。
1、外植体的选择
选取生长健壮、无病虫害、幼嫩的月季嫩枝。
三、方法与步骤
。
2、外植体的预处理
剪掉叶片、皮刺，切成适宜大小，用自来水和洗衣粉水将材料充分洗净待用。
三、方法与步骤
3、外植体的表面灭菌
（1）接种前30min打开无菌操作间和超净工作台的紫外灯进行环境灭菌。
（2）照射20min后关闭紫外灯，打开风机使超净工作台处于工作状态。
三、方法与步骤
3、外植体的表面灭菌
（3）将接种工具、灭菌的玻璃器皿、无菌水、配制好的灭菌剂等放入超净工作台。
（4）接种人员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等。
（5）接种人员上工作台后，用75%酒精擦拭双手，然后擦拭工作台面。
三、方法与步骤
3、外植体的表面灭菌
（6）点燃酒精灯，用75%酒精擦拭接种工具并反复灼烧灭菌。
（7）外植体表面灭菌：加入75%的酒精，浸泡30S，取出后放入2％的次氯酸钠溶液浸泡12min，用无菌水反复冲洗3次。
三、方法与步骤
4、外植体的接种
先打开已准备好的培养基瓶盖或封口膜，将培养基瓶倾斜拿在手中，使瓶口靠近酒精灯火焰，并将瓶口在火焰上方转动灼烧数秒钟。
然后用镊子夹取一块切好的外植体送入瓶内，轻轻插在培养基上。
茎段要按其生长极性的上下端，正放在培养基上。
三、方法与步骤
5、培养
做好记录，注明处理材料的物种名称、处理方法、接种日期等，放入培养室培养。
三、方法与步骤
1.材料消毒后应尽快切取所需的外植体接入培养基中，减少在空气中暴露的时间，以避免风干和褐变。
2.茎尖、茎段外植体接种到培养基中时要注意材料的形态学上下端，即形态学上端应向上，否则会影响其生长。
3.叶片通常将叶背接触培养基，因为叶背气孔多，有利于吸收水分和养分。
四、注意事项
4.接种人员在操作时应尽量少谈话，减少走动，以避免空气的流动而增加污染的机率。
5.材料剪取、开瓶接种等操作都必须在酒精灯火焰的有效范围内进行，防止杂菌落入瓶中。
四、注意事项
培养过程跟踪观察，统计各项指标，及时分析并有效解决存在的问题，发现污染苗及时清洗。
五、观察记录
月季外植体的灭菌与接种技能实训评价与考核标准参照教材中表4-2执行。
六、评价与考核
1.外植体灭菌接种时，应注意哪些事项？
2.实训操作中出现了哪些问题？并加以分析。
3.接种一周后统计污染率，成活率，死亡率。
任务反思
任务4.2 继代培养
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.了解继代增殖培养的特点。
2.掌握继代培养阶段基本操作方法步骤。
1.能根据生产计划设计继代培养流程。
2.能根据组培苗的增殖类型进行规范的继代转接。
任务目标
一、继代培养基的配制与灭菌
二、继代培养的操作步骤
任务准备
一、继代培养基的配制与灭菌
不同植物继代增殖培养基不同，通常用MS作为基本培养基，添加较多的细胞分裂素和少量的生长素，以促进细胞分裂和伸长。
二、继代培养的操作步骤
（一）选苗
选取无污染的组培苗，选苗时要仔细观察，检查是否有细菌污染或真菌污染，避免因母瓶污染，导致后期转接的苗出现污染。
二、继代培养的操作步骤
（二）取苗
取苗时组培瓶口要靠近酒精灯火焰区，瓶口外缘在酒精灯上灼烧，然后轻轻取下瓶盖，瓶口尽量靠近火焰区，然后把瓶口外缘在酒精灯上灼烧一下，取出苗后及时封口。一次取苗不可太多，以免风干。
二、继代培养的操作步骤
（三）切苗
切苗时镊子和手术刀都不可太热，且接种过程中，刀和镊子不可在接种盘正上方操作，一般左右手分工合作，避免交叉污染。切苗时，切掉老叶、黄叶等垃圾可堆放在接种盘的一侧，接种材料放在另外一侧。
二、继代培养的操作步骤
（四）接苗
接种前要灼烧瓶口，镊子最好不要与瓶口接触，操作人员不能对着瓶口讲话，一般100mL瓶内接5-10株苗，不要放太多。组培苗在瓶内摆放均匀、整齐、深度一致。
二、继代培养的操作步骤
（五）封口
接种完之后及时封口，松紧度以手转不动为准。封口前在酒精灯上灼烧瓶口。
二、继代培养的操作步骤
（六）记录
把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。清理和关闭超净工作台。
组培苗的继代培养技能实训
一、目的与要求
二、仪器用具与试剂
三、方法与步骤
四、观察记录
五、评价与考核
任务实施
掌握组培苗转接时的基本操作步骤，提高无菌操作能力，降低污染率。
一、目的与要求
。
1、仪器用具
2、试剂
3、植物材料
二、仪器用具与试剂
。
1、前期准备
提前配好培养基，经过严格消毒后放入超净工作台内，紫外灯灭菌20min，将待转接的组培苗放入超净工作台内，按要求消毒台面。
三、方法与步骤
。
2、取苗
先打开培养瓶的瓶盖（或封口膜），如果不能一次取出其内的全部材料，要先把瓶盖（或封口膜）盖回去。
操作过程中瓶口要靠近酒精灯火焰区，然后把瓶口外缘在酒精灯上烤一下，正式取苗时，瓶口尽量靠近火焰区，取出苗后及时盖好。
一次取苗不可太多，以免风干。
三、方法与步骤
3、切苗
接种盘不可太往外，镊子和手术刀都不可太热。
在操作过程中，刀和镊子不可在培养皿正上方操作。
在切苗过程中产生的垃圾可堆放在接种盘内的一侧位置上，不可弄到接种盘外。
三、方法与步骤
4、接种
接种时镊子最好不要与瓶口接触。
苗不要放太多，组培苗在瓶内要排放均匀、整齐、深度适宜。
封口前也要在酒精灯上烤下瓶口。
三、方法与步骤
5、记录
把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。
三、方法与步骤
培养过程跟踪观察，统计各项指标，及时分析并有效解决存在的问题，发现污染苗及时清洗。
四、观察记录
组培苗的继代培养技能实训评价与考核标准参照教材中表4-4执行。
五、评价与考核
1.继代培养接种时，应如何分割培养的材料？应注意哪些问题？
2.一周后统计学生接种的污染率。
任务反思
任务4.3 壮苗与生根培养
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.了解壮苗与生根培养的意义。
2.掌握影响试管苗生根的因素。
3.掌握试管苗生根的常用方法。
1.会配制生根培养基，并为试管苗提供适当的培养条件。
2.能运用所学知识解决试管苗生根过程中遇到的一些问题。
任务目标
一、壮苗与生根培养的意义
二、影响组培苗生根的因素
三、壮苗生根培养的方法
任务准备
一、壮苗与生根培养的意义
继代培养对于任何植物来说都不可能无限度的进行。
受生产计划和生产规模的限制，增殖到一定数量或代数后必须分流进入壮苗、生根培养阶段。
二、影响组培苗生根的因素
（一）植物材料
不同植物、不同的基因型、甚至同一植株的不同部位对根的分化都有决定性的影响。
木本植物较草本植物难，成年树较幼年树难，乔木较灌木难，同一植物中上部材料较基部材料难，休眠季节较开始旺盛生长的季节难。
二、影响组培苗生根的因素
（二）基本培养基
生根培养基多采用1/2MS或1/2大量元素培养基。
低浓度的蔗糖对试管苗的生根有利，且有利于试管苗的生活方式由异养到自养转变，提高生根苗的移栽成活率，浓度一般在1%～3%。
大量元素减半
二、影响组培苗生根的因素
（三）植物生长调节剂
一般各种类型的生长素均能促进生根。
植物生长延缓剂对不定根的形成具有良好的作用。
生根培养中常用IBA、NAA和2，4-D等。
生根粉(ABT)也可促进不定根的形成。
二、影响组培苗生根的因素
（四）继代培养代数
随着继代代数的增加，生根能力有所提高。
杜鹃、杨树、葡萄等经过若干次继代培养能提高生根率。
二、影响组培苗生根的因素
（五）光照
光照强度和光照时数对生根的影响十分复杂。
一般认为生根不需要光，但草莓根系的生长发育则以较强的光照为好。
二、影响组培苗生根的因素
（六）pH
不同植物对pH值要求各异，一般为5.0～6.0。
二、影响组培苗生根的因素
（七）温度
一般为16℃-25℃，过高过低均不利于生根。
草莓继代培养芽再生的适宜温度为32℃，生根温度则以28℃最好。
二、影响组培苗生根的因素
（八）其他物质
一般认为黑暗条件对根的生长有利，因此在生根培养基中加入适量的活性炭对许多植物的生根均有利。
三、壮苗生根培养的方法
（一）瓶内生根法
将成丛的组培苗分离成单株或小丛，转接到生根培养基，使之迅速生根，草本植物大约7d左右即可生根，木本植物约10～15d生根。
当小植株生出3～5条水平根，每条根长1～2cm时，为最适宜的出瓶炼苗阶段。
三、壮苗生根培养的方法
（二）瓶外生根法
把试管扩繁的嫩枝当作微型插条，直接插入基质中生根成活。
采取瓶外生根技术可以减少生根总费用的70%左右。
组培苗的生根培养技能实训
一、目的与要求
二、仪器用具与试剂
三、方法与步骤
四、观察记录
五、评价与考核
任务实施
学会配制生根培养基，并会对不同的组培苗进行生根诱导，能对转入壮苗生根阶段的瓶苗进行熟练的生根转接，能够根据瓶苗的种类和数量制定可行的生根培养方案。
一、目的与要求
。
1、仪器用具
2、试剂
3、植物材料
二、仪器用具与试剂
。
1、前期准备
制备生根培养基，分装，包扎后，进行高压蒸汽灭菌，然后放入超净工作台内备用。
操作前20min打开超净工作台紫外灯，时间到了关闭紫外灯，将待转接的组培苗放入超净工作台内，按要求消毒台面。
三、方法与步骤
。
2、生根苗的切割与接种
左手拿接种瓶，右手拿弯头剪，将待生根的培养材料剪成1.5～2cm的茎段。
迅速转移到新鲜的生根培养基中，按极性插植，每瓶转接8～10株。
手不能从打开的接种瓶上方经过，以免灰尘和微生物落入，造成污染。
三、方法与步骤
3、封口
封口前要在酒精灯上烤下瓶口。
三、方法与步骤
4、记录
把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。
三、方法与步骤
5、培养与观察
将培养苗放到培养室适宜条件下培养，培养过程中及时观察记录生根的数量、生根情况等。
三、方法与步骤
培养过程跟踪观察，统计各项指标，及时分析并有效解决存在的问题，发现污染苗及时清洗。
四、观察记录
组培苗的生根培养技能实训评价与考核标准参照教材中表4-6执行。
五、评价与考核
1.简述生根培养的技术要求。
2.影响组培苗生根的因素有哪些？
任务反思
任务4.4 驯化移栽与苗期管理
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.了解组培苗培养的环境及特点。
2.掌握组培苗驯化的方法。
3.熟练掌握组培苗移栽的基本步骤和方法。
1.能规范地对试管苗进行驯化和移栽操作。
2.能进行正确的苗期管理。
任务目标
一、组培苗生存环境与自然环境的差异
二、组培苗的特点
三、组培苗的驯化
四、组培苗的移栽
五、苗期管理
任务准备
一、组培苗生存环境与自然环境的差异
1.高温且恒温
2.高湿
3.弱光
4.无菌
5.异养
二、 组培苗的特点
生长细弱，角质层不发达；
叶片气孔数少，活性差；
叶绿体光合性能差；
根系不发达，吸收功能弱；
对逆境的适应性和抵抗能力差。
三、组培苗的驯化
1.驯化目的：提高组培苗对自然条件的适应性，促其健壮，最终提高移栽成活率。
2.驯化原则：驯化开始的数天内，创造与培养环境条件相似的条件；后期则创造与预计栽培条件相似的条件，逐步适应。
3.驯化方法：将组培苗从培养室转移至驯化温室，不开口，自然光下放置7-10d，然后打开封口材料继续放置1-2 d。
四、组培苗的移栽
（一）移栽基质的选择
基质要求透气、保湿和具一定肥力，容易进行灭菌处理，不利于杂菌滋生。
河沙、蛭石、草炭土、珍珠岩、腐殖土等。
四、组培苗的移栽
（二）苗床准备
草本植物移栽于苗床（宽度1m）中，直接在苗床中铺上已灭菌的基质，浇透水即可。
四、组培苗的移栽
（三）组培苗出瓶及清洗
将组培苗打开瓶口，用镊子把小苗从瓶中取出放于盛有清水的盆中，注意尽量不伤根。然后在清水中轻轻洗去黏附于小苗根部的培养基，要洗得干净又少伤根。
四、组培苗的移栽
（四）移栽
在苗床（按照5cm株距、8cm行距）或钵中用竹签打孔，将洗好的小苗插于孔中并将孔覆严，移栽完毕用喷壶浇一遍水，以保证根系与基质充分接触。
在苗床（按照5cm株距、8cm行距）或钵中用竹签打孔，将洗好的小苗插于孔中并将孔覆严，移栽完毕用喷壶浇一遍水，以保证根系与基质充分接触
五、苗期管理
（一）保持小苗的水分供需平衡
培养基质要浇透水，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。
5～7d后，逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。
五、苗期管理
（二）防止菌类滋生
基质进行高压灭菌或烘烤灭菌。
适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效的保护幼苗。
喷水时可加入0.1%的尿素，或用1/2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快幼苗的生长与成活。
五、苗期管理
（三）保证适宜的温度和光照条件
冬春季地温较低时，可用电热线来加温。
在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。
组培苗的驯化与移栽技能实训
一、目的与要求
二、仪器用具与材料
三、方法与步骤
四、观察记录
五、评价与考核
任务实施
掌握组培苗驯化和出瓶移栽的基本方法。
一、目的与要求
。
1、仪器用具
2、植物材料
二、仪器用具与材料
。
1、组培苗的驯化
当组培苗的根嫩白色，一般具有2～3条根，根长1～2cm时，将生根瓶苗的培养瓶转移至塑料大棚内遮光率50％～70％的遮阳网下进行锻炼。不打开瓶口，自然光下放置7～10d，然后打开封口材料继续放置1～2d。
三、方法与步骤
。
2、育苗容器准备
草本植物：穴盘（5％高锰酸钾溶液浸泡消毒，装填栽培基质，用木板刮平）。
木本植物：塑料营养钵，将营养钵排于苗床中，钵中装填基质至距钵缘0.5～1cm处。基质装填完成后浇透水。
三、方法与步骤
3、组培苗出瓶及洗苗
将组培苗打开瓶口，用镊子把小苗从瓶中取出放于盛有清水的盆中，注意尽量不伤根。
然后在清水中轻轻洗去黏附于小苗根部的培养基，要洗得干净又少伤根。
三、方法与步骤
4、移栽
在苗床（按照5cm株距、8cm行距）或钵中用竹签打孔，将洗好的小苗插于孔中并将孔覆严，移栽完毕用喷壶浇一遍水，以保证根系与基质充分接触。
三、方法与步骤
4、遮阳
插上竹坯，盖上塑料膜，再在小拱棚上盖上遮阳网，做好保湿和遮阳工作。
三、方法与步骤
培养过程跟踪观察，统计各项指标，及时分析并有效解决存在的问题。
四、观察记录
组培苗的驯化与移栽技能实训评价与考核标准参照教材中表4-8执行。
五、评价与考核
1.分析总结组培苗驯化移栽的方法步骤。
2.简述如何提高移栽成活率。
任务反思
谢谢聆听！

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