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高等教育出版社
农业微生物及其基本操作技术
项目7 农业微生物及其基本操作技术
项目目录
项目导入
任务7.1 微生物基础知识
任务7.2 农业微生物分离技术
任务7.3 农业微生物培养、保藏技术
项目目录
项目导入
小艺从小对自然科学就很感兴趣。一天她和父母去郊游，看到地里的植物生了病，长了灰色毛，或者长了黄斑，他就想“是什么原因导致植物生病的呢？”。经过咨询和网络查询。他知道这是由于微生物引起的病害，她又想知道微生物是不是都是有害的呢？……
任务7.1 微生物基础知识
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.微生物的定义
2.微生物的结构形态
3.微生物的生活史及营养代谢
1.显微观察技术。
2.微生物制片技术。
任务目标
一、微生物定义、分类
二、微生物的形态、结构
三、微生物的生活史、营养代谢
任务准备
一.微生物定义、分类
微生物是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称，通常包括病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）、具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、原生动物和单细胞藻类。
特征：
形体微小，结构简单；
分布广，种类多；
生长繁殖快，代谢能力强；
易发生变异；
一、微生物定义、分类
一、微生物定义、分类
林奈双名法：属名 + 种名 + （首次定名人）+ 现定名人 + 定名年份。
说明：
（1）属名：拉丁文的名词或作名词的形容词，字首大写，斜体。
（2）种名：为拉丁文形容词，为微生物次要特征，字首小写，斜体。
（3）在生产实践中，当一个菌种未进行鉴定以前往往用微生物菌株的名称。
Bacillus subtilis（枯草杆菌）（Ehrenberg） Cohn，1872
字首大写，斜体
字首小写，斜体
首次定名人
现定名人
定名年份
二、微生物的形态、结构
细菌基本形态
球状
杆状
螺旋状
二、微生物的形态、结构
放线菌的菌丝体分为基内菌丝（营养菌丝）、气生菌丝和孢子丝
二、微生物的形态、结构
酵母菌的个体类似细菌，大多数为单细胞，一般呈球形、卵形或圆柱形，有些菌体能互相连接并延长成菌丝体，称假菌丝
二、微生物的形态、结构
霉菌营养体的基本单位是菌丝，菌丝通常呈管状。低等霉菌的菌丝没有横隔膜，高等霉菌的菌丝有横隔膜，分为基内菌丝和气生菌丝，在气生菌丝顶端可产生各种孢子。
二、微生物的形态、结构
担子菌形成大型子实体
二、微生物的形态、结构
微生物大小：
（1）球菌的大小：以直径表示，直径多为0.5～1μm；
杆菌的大小：以宽×长表示，多为（0.5～1）μm ×5μm；
螺旋菌的大小：以宽×高表示，多为（0.5～2）μm ×（1～50）μm；
（2）放线菌的菌丝，以菌丝宽度表示，宽度1μm 左右；
（3）酵母菌的大小：以宽×长表示，宽1～5μm ，长5～30μm；
（4）霉菌菌丝，以菌丝宽度表示，一般宽5～10μm ，少数小至0.5μm，大到100μm。
二、微生物的形态、结构
微生物菌落
（1）菌落定义
微生物在固体培养基上，由一个菌体在一定温度下经过一定时间的培养，生长繁殖成为肉眼可见并具有一定形状的群体结构，称为菌落。
（2）细菌菌落
在固体培养基上多数表面光滑、湿润、半透明或不透明，大多数呈圆形，也有呈分枝状或不规则扩展状。
（3）放线菌菌落
在固体培养基上一般为圆形、平坦或有皱褶，边缘有辐射状菌丝，质地紧密、坚实、不能无限扩张，形成孢子后，表面呈粉末状。
（4）酵母菌菌落
大而厚，多数不透明，一般为圆形，表面光滑、粘稠、湿润呈油脂状，多数为乳白色，少数为粉红色或红色，易挑起。
（5）霉菌菌落
呈绒毛状，棉絮状或蜘蛛网状，疏松，初呈白色或浅色，后长出各种颜色的孢子，产色素，培养基正面、反面显示出不同颜色。
二、微生物的形态、结构
微生物的结构
细菌：细胞壁、细胞膜、细胞质及原核。特殊结构有鞭毛、荚膜、芽孢等。
酵母菌：细胞壁、细胞膜、原生质、细胞核、内含物组成。
霉菌：细胞壁、细胞膜、原生质、细胞核、内含物、菌丝隔膜。
三、微生物的生活史、营养代谢
细菌生活史
放线菌生活史
三、微生物的生活史、营养代谢
酵母菌生活史
根霉生活史
三、微生物的生活史、营养代谢
丝状真菌的生活史
三、微生物的生活史、营养代谢
六大营养：碳源、氮源、无机盐、生长因子、能量和水；
四种营养类型：光能自养型、光能异养型、化能自养型、化能异养型；
微生物培养基：天然培养基、半合成培养基、合成培养基；
也可按形态分为：液体培养基、固体培养基和半固体培养基。
细菌形态观察实训
一、材料准备
二、人员组织
三、操作步骤
四、注意事项
五、评价与考核
任务实施
一、材料准备
。
金黄色葡萄球菌试管菌种、大肠杆菌试管菌种、载玻片、盖玻片、接种环、滴瓶（装蒸馏水）、擦镜纸、二甲苯、香柏油、结晶紫染色液、酒精灯、光学显微镜、洗瓶、废液缸等
二、人员组织
。
将人员按照4人一个小组，进行任务分工，分别分为材料准备组、观察玻片制备组、显微镜检观察绘图组，在完成各自任务后，3个小组再轮换子任务，进行反复练习技能。
1、涂片：取洁净的载玻片，用擦镜纸搽拭干净，从滴瓶中取半滴蒸馏水放置到载玻片上，用接种环从菌种试管中取一环菌，在载玻片上的水滴中均匀涂开，直至菌苔完全散开。
三、操作步骤
。
2、固定：将玻片置于酒精灯火焰10cm上方，烘干，然后将玻片穿过火焰2～3次，完成细菌菌体的固定。
三、操作步骤
3、染色：取半滴结晶紫染色液滴到菌固定区域，并用牙签轻轻涂开，覆盖整个区域，染色1～2分钟。然后，用洗瓶冲洗玻片上边缘，让蒸馏水从上边缘流过染色区域，洗掉染色液。然后将玻片置于酒精灯火焰10cm上方烘干。
4、镜检：将玻片在低倍镜下观察，找到染色的视野，然后在玻片染色区域滴加香柏油，转换油镜观察。
三、操作步骤
5、绘图：将显微镜下观察的影像，按照生物绘图的方法进行绘制。
1、涂片时取菌不要太多，适量即可。
2、洗染色液时，洗瓶的水流不能直接对着染色区域，以免洗掉菌体。
四、注意事项
五、评价与考核
考核内容 考核标准 分值 小组互评 教师评价
准备工作 物品准备齐全，人员安排合理 10
涂片 涂片方法正确，菌苔完全散开 15
固定 固定方法正确 15
染色 染色方法正确，染色适宜 20
镜检 镜检方法正确，先低倍后高倍（或油镜） 20
绘图 绘图清晰、准确 20
总分 100
酵母菌形态观察实训
一、材料准备
二、人员组织
三、操作步骤
四、注意事项
五、评价与考核
任务实施
酵母试管菌种、载玻片、盖玻片、接种环、滴瓶（装蒸馏水）、擦镜纸、光学显微镜、洗瓶、废液缸等。
一、材料准备
将人员按照4人一个小组，进行任务分工，分别分为材料准备组、观察玻片制备组、显微镜检观察绘图组，在完成各自任务后，3个小组再轮换子任务，进行反复练习技能。
二、人员组织
。
1、涂片：与细菌涂片方法一致。
2、镜检：将玻片在低倍镜下观察，找到的有酵母的视野，转换高倍镜观察。
3、绘图：将显微镜下观察的影像，按照生物绘图的方法进行绘制。
三、操作步骤
。
1、放置盖玻片时，从一侧拖至涂片区域，缓慢放下，不要产生气泡。
2、由于酵母菌体颜色淡，在调整显微镜视野时采用“高光强、低通光量”的方式调整视野，更容易观察到菌体。
四、注意事项
。
五、评价与考核
。
考核内容 考核标准 分值 小组互评 教师评价
准备工作 物品准备齐全，人员安排合理 10
涂片 涂片方法正确，菌苔完全散开 20
镜检 镜检方法正确，先低倍后高倍（或油镜） 30
绘图 绘图清晰、准确 40
总分 100
霉菌形态观察实训
一、材料准备
二、人员组织
三、操作步骤
四、注意事项
五、评价与考核
任务实施
根霉试管菌种、曲霉试管菌种、毛霉试管菌种、载玻片、盖玻片、接种针、滴瓶（装蒸馏水）、擦镜纸、光学显微镜、洗瓶、废液缸等。
一、材料准备
将人员按照4人一个小组，进行任务分工，分别分为材料准备组、观察玻片制备组、显微镜检观察绘图组，在完成各自任务后，3个小组再轮换子任务，进行反复练习技能。
二、人员组织
1、制片：取洁净的载玻片，用擦镜纸搽拭干净，从滴瓶中取半滴蒸馏水放置到载玻片上，用接种针从试管菌种中取霉菌菌丝体，放置在蒸馏水中，盖上盖玻片。
2、镜检：将玻片在低倍镜下观察。
3、绘图：变换5个视野，绘制显微镜检图。
三、操作步骤
菌丝体放置在蒸馏水中，要用2支接种针将菌丝体拉开，避免成团，无法观察。
四、注意事项
五、评价与考核
。
考核内容 考核标准 分值 小组互评 教师评价
准备工作 物品准备齐全，人员安排合理 10
制片 制片方法正确，菌苔完全散开 20
镜检 镜检方法正确，先低倍后高倍（或油镜） 30
绘图 绘图清晰、准确 40
总分 100
1.微生物命名法则是什么？
2.简述微生物的概念和特征。
3.如何对菌落进行形态描述？
4.回顾微生物形态观察实训过程，总结经验。归纳实验步骤、技术要点和注意事项，并撰写实训报告。
任务反思
任务7.2 农业微生物分离技术
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.微生物的分离思路。
2.微生物的分离方法。
1.土壤中细菌的分离技术。
2.植物上的真菌分离技术。
任务目标
一、菌种的分离方法、分离思路
二、土壤中细菌分离步骤
三、植物上的真菌分离步骤
任务准备
一、菌种的分离方法、分离思路
1.分离方法
（1）分离的本质：就是将特定的微生物从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来，建立纯培养物的过程。
（2）细菌、单细胞微生物的分离方法：稀释法、鉴别分离法
稀释法：稀释涂布平板法、平板划线法、稀释摇管法
鉴别分离法：鉴别培养基分离技术
（3）丝状真菌和放线菌的分离方法：组织分离法、孢子分离法
一、菌种的分离方法、分离思路
2.分离思路
（1）优势菌的分离思路
细菌、单细胞微生物：直接稀释、涂布、分离；
丝状真菌、放线菌：组织分离、孢子稀释分离；
备注：有些菌的分离可以使用鉴别分离法，如大肠杆菌用EMB培养基。
（2）不占优势菌的分离思路
细菌、单细胞微生物：特定目标菌的富集培养，目标菌菌数增高，再稀释法分离；
丝状真菌、放线菌：特定目标菌的预培养，目标菌菌量增加，再分离；
富集培养遵循的原则：培养基成分调整、培养条件调整、加入抑制杂菌物质；
二、土壤中细菌分离步骤
分离流程：
查资料、定方案→土壤采样→样品预处理→稀释分离→纯化→鉴定及性能测试
1.查资料、定方案
通过中国期刊网查询资料。
一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多；采样季节以温度适中，雨量不多的秋初为好。
二、土壤中细菌分离步骤
2.土壤样品采样
按照统计学观点五点取样，取表层下5-15cm下土样，注意不要污染样品。
二、土壤中细菌分离步骤
3.土壤样品预处理
研磨时不要污染样品，无菌水浸提制备菌悬液。
土壤浸提液制备的菌悬液
二、土壤中细菌分离步骤
4.稀释分离
可以使用10的梯度稀释法，也可不必，只要稀释倍数合适，在分离的平板培养基上也能够形成单菌落。
二、土壤中细菌分离步骤
培养基平板制备过程如下：
称量药品→融化药品→调pH（细菌7.0，真菌6.5）→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌。
培养基灭菌过程如下：
加水→装锅→加热排气（0.05Mpa，2～3次）→升温保压灭菌0.1～0.15MPa，121～125℃，20～30min）→降压出锅→搁置斜面或倒平板→无菌检查（37℃， 24～48h）。
请同学，跟随老师，进行实物演示学习。
并讨论、汇报！
二、土壤中细菌分离步骤
5.纯化
可以取单菌落，重复稀释法纯化，也可以使用“三区划线”的方法。
二、土壤中细菌分离步骤
6.鉴定及性能测试
一般依据鉴定手册进行，目前使用分子生物学手段，通过测定基因序列，可以达到快速、准确的目的。
三、植物上的真菌分离步骤
分离流程
查资料、定方案→植物采样→样品预处理→分离→纯化→鉴定及性能测试
1.查资料、定方案
查阅植物病原真菌的分离方法、真菌特性、培养基配方及培养条件等。
如何快速阅读资料？
听取老师的讲述
三、植物上的真菌分离步骤
2.植物采样
采样样品时的天气最好选择阴天多云的日子，选择采集典型的病部叶片，叶斑病害应取病健交界处进行分离。样品应尽快送往实验室分离。
三、植物上的真菌分离步骤
3.植物样品预处理
采集的叶片，先用洁净的清水洗去叶片上的灰尘和杂物，阴凉处晾干备用。
三、植物上的真菌分离步骤
4.分离
取真菌性叶斑病的新鲜病叶，用剪刀剪取病健交界处的组织(边长4～5mm)数块；将病组织放入70%酒精中浸3～5s后，将病组织在0.1%升汞(氯化汞)液中消毒1min，然后在无菌水中连续漂洗3次，除去表面残留的消毒剂；按无菌操作规程将病组织移入平板培养基表面上，一般每皿放4～5块，并用玻璃铅笔注明培养材料的编号和种类；将平板培养基倒置后放入恒温箱内，在25℃下培养3～4d后，将分离的目的菌在无菌条件下移入斜面培养基上，淘汰杂菌。
三、植物上的真菌分离步骤
5.纯化
待平板上长出菌丝时，用解剖刀将菌落边缘切下，移入试管斜面，25℃培养，待长好后，4℃保藏备用。
三、植物上的真菌分离步骤
6.菌种鉴定及性能测定
根据真菌鉴定方法（以魏景超《真菌鉴定手册》为准）对真菌进行鉴定，并对有意义的生产性状进行进一步地研究。
土壤中细菌的分离（以分离芽孢杆菌为例）实训
一、材料准备
二、人员组织
三、操作步骤
四、注意事项
五、评价与考核
任务实施
小锅、天平、电炉、pH纸、漏斗、纱布、棉花、橡皮筋、试管、培养皿、灭菌锅、报纸、1mL移液管、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、涂布棒等。
一、材料准备
。
将人员按照4人一个小组，进行任务分工，分别分为材料准备组、取样组、培养基制作组、涂布分离组、培养观察组，在完成各自任务后，各小组再轮换子任务，进行反复练习技能。
二、人员组织
。
1、取样：将土壤表面落叶、浮土去掉，用土样取样器进行取样，取表层以下2-3cm土样100g，共取5个取样点，合计500g，送回实验室。
2、集中、均样：将土样混合，除去大的杂质，按照四分法进行均样，取到所需要的土样，一般取混合的土样10g备用。
三、操作步骤
。
3、培养基制作：按照给定的培养基配方配制培养基。
配方如下：蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g、水1000ml、pH 7.3。
三、操作步骤
。
4、配制菌悬液：将10g土样放入事先已灭菌过的无菌水中，摇匀、配制成菌悬液，静止，取上清液放入60℃热水中，水浴15min，得到待分离菌液。
5、稀释：梯度稀释或者稀释到合适倍数。
6、涂布、培养：取合适的稀释度0.1-0.2ml放入固体培养基平板中，涂布平板，30℃，培养24h，挑取单菌落，转接到斜面。
三、操作步骤
。
1、梯度稀释操作时，应注意每个稀释度的样品一定要摇匀。
2、移液管口部灭菌前，要放置棉花，用报纸包扎好，灭菌备用。棉花可以起到过滤保护的作用。
3、从每个梯度取样时，应注意每个梯度更换一支无菌移液管，防止交叉感染。
四、注意事项
。
4、涂布平板时，涂布器在培养皿中要正转三圈，反转三圈，涂布均匀。
5、4℃冰箱中保存的样品不得超过24h。
6、土样浸提液水浴温度不可高于75℃（非芽孢菌不要水浴），时间不得少于10min。
四、注意事项
五、评价与考核
考核内容 考核标准 分值 小组互评 教师评价
准备工作 物品准备齐全，人员安排合理 10
取样 取样点选取合理，取样方法正确。 20
均样 均样方法正确，取样代表性、数量符合要求。 10
培养基制作 能按照给定配方，配制培养基，平板培养基制作规范。 25
配制菌悬液 菌悬液配置方法正确。 10
梯度稀释 能正确进行菌悬液梯度稀释。 15
涂布、培养 涂布平板方法正确，培养温度适宜，定时观察和记录全面。 10
总分 100
植物上的真菌分离（以叶片病原菌分离为例）实训
一、材料准备
二、人员组织
三、操作步骤
四、注意事项
五、评价与考核
任务实施
解剖刀、0.1%的升汞溶液、75%酒精，其他与细菌基本一致。
一、材料准备
。
将人员按照4人一个小组，进行任务分工，分别分为材料准备组、取样组、培养基制作组、涂布分离组、培养观察组，在完成各自任务后，各小组再轮换任务，进行反复练习技能。
二、人员组织
1、取样：取发病叶片，沿病健交界处将叶片剪成2-3cm2大小的叶片，备用。
2、培养基制作：一般使用PDA培养基进行分离。
配方如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1000ml、pH自然。
三、操作步骤
3、消毒、灭菌：将叶片放入70%酒精浸润20S，迅速移入升汞溶液中进行表面灭菌50S，期间不断振荡，以增加灭菌效果，再放入无菌水中，水洗3次，每次2-3min，洗净残留的升汞溶液。用灭菌过的吸水纸将叶片上的无菌水吸干。
三、操作步骤
3、培养观察：将灭过菌的叶片放入PDA固体培养基上，25℃，培养3d，观察病原菌生长情况，记录菌落特征。
三、操作步骤
1、无菌水水洗时，每次不得少于3min，洗涤时必须不断振荡，尽量洗下残留的升汞溶液。
2、70%酒精处理时间不得多于30S，否则，叶片组织容易变黑，分离难度增大。
3、培养基中加入1-5%的植物组织浸提液，可提高分离效果。
四、注意事项
4、为了防止杂菌污染，可以加入抗生素，抑制杂菌，提高分离效果。
5、升汞20g，加浓盐酸100mL，使用时取5mL原液加995mL水即成；也可用升汞1g，盐酸2.5mL，水1000mL，先将升汞溶于盐酸中，再加水稀释即成。因升汞剧毒，通常在配制好的溶液中加入红色或蓝色的颜料。
四、注意事项
6、分离前还要用70%酒精擦拭双手，工作过程中，应尽量少说话，呼吸要轻。。
四、注意事项
五、评价与考核
。
考核内容 考核标准 分值 小组互评 教师评价
准备工作 物品准备齐全，人员安排合理 10
取样 取样方法正确。 20
培养基制作 能按照给定配方，配制培养基，平板培养基制作规范。 30
消毒灭菌 叶片消毒灭菌方法正确。 25
培养观察 接种方法正确，培养温度适宜，定时观察和记录全面。 15
总分 100
1.优势菌的分离思路是什么？
2.简述土壤中细菌的分离技术路线。
3.简述植物上真菌的分离技术路线。
4.回顾土壤中细菌、植物上真菌的分离过程，总结经验，撰写实训报告。
任务反思
任务7.3 农业微生物培养、保藏技术
任务目标
任务准备
任务实施
任务反思
1.微生物的培养方法。
2.微生物的保藏原理。
1.微生物的培养技术。
2.微生物的保藏技术。
任务目标
一、微生物培养
二、微生物保藏
任务准备
一、微生物培养
流程
斜面菌种→活化→平板接种→培养→收获
1.平板培养技术
操作步骤要点
活化：就是将保藏的处于休眠状态的微生物细胞恢复到正常生长分裂状态；
平板接种：需要注意无菌操作，注意不要污染，在超净台上操作；
一、微生物培养
1.平板培养技术
操作步骤要点
超净台使用的一般步骤：紫外线灭菌30min，75%酒精台面消毒、手部消毒，点燃酒精灯，在火焰区域附近操作。
培养：设定好温度、湿度。注意防止污染，可以提前对培养设备进行消毒，管控好湿度等方式，减少污染。
收获：要及时观察，不要把菌种培养的“过老”，菌龄过大的菌种不适宜保种。
一、微生物培养
流程
斜面菌种→活化→基料接种→培养→收获
2.固体基料培养技术
操作步骤要点
活化：与平板培养一致；
基料接种：操作环境要洁净，事先对房间、操作面、器具进行消毒，固体基料提前灭菌，人员需要消毒净化，采用浅盘接种的方式进行；
培养：注意基料温度，防止污染；
收获：及时收获，保藏。
一、微生物培养
流程
斜面菌种→活化→摇瓶接种→振荡培养→收获
3.摇瓶培养技术
操作步骤要点
活化：与平板培养一致；
摇瓶接种：接种时要注意无菌操作，不要污染；接种应当先配制菌悬液，按照接种量（一般为10%）。
振荡培养：注意提前对培养设备进行消毒，减少污染；设定好转速、温度，进行培养。
收获：应及时收获，收获时要注意判断是否有污染，菌量是否达标等。
一、微生物培养
流程
斜面菌种→活化→摇瓶种子培养→发酵罐接种→发酵与控制→放罐→收获
4.发酵罐液体深层培养技术
操作步骤要点
活化、摇瓶接种：与摇瓶培养一致；
发酵罐接种：采用火环保护下接种，注意接种时罐内空气是向外吹的，罐压在0.05MPa，要快、准、稳；接种前应对发酵罐进行空消、实消，通入无菌风等操作。
一、微生物培养
4.发酵罐液体深层培养技术
操作步骤要点
发酵与控制：通过控制面板设置参数，如温度、通气量、转速等，控制发酵，如罐压，防止污染；及时检测生物量、残糖量、粗蛋白含量等指标。
放罐：达到发酵终点，进行放罐、洗罐、空消等操作；
收获：收获后的发酵液，进入下游阶段进行处理；
1 皮带轮；2轴承支柱；3联轴节；4轴封；5视镜；6取样口；7冷水出口；8夹套；9螺旋片；10温度插口；11轴；12搅拌桨；13底轴承；14放料口；15冷水进口；16通气管；17热电偶接口；18挡板；19冷水出口；20人孔；21电机
二、微生物保藏
1.保藏的依据、方式
（1）依据
依据：存活、不污染，遗传稳定；技术手段：低温、干燥、限制氧气等；
（2）方式
二、微生物保藏
2. 4℃斜面菌种保藏技术
流程
待保藏的菌种→活化→接种培养→选优→保藏→定期检查
操作步骤要点
活化：转接斜面后，不要写错编号；
接种培养：接种时要查看待接斜面是否有污染；培养时要定期观察；培养条件、培养基配方都要控制；
二、微生物保藏
2. 4℃斜面菌种保藏技术
操作步骤要点
选优：选择生长状态良好、划线均匀、无污染的试管斜面；
保藏：先对保藏的冰箱或冷藏柜进行消毒，再放入需要保藏的菌种；
定期检查：查看保藏的菌种，如出现问题，要及时转接出菌种；
二、微生物保藏
3.明胶颗粒保藏技术
流程
待保藏的菌种→活化→菌悬液制备→明胶颗粒制备→硅胶管准备→保藏→ 定期检查
操作步骤要点
活化：与斜面菌种保藏一致；
菌悬液制备：选择优质试管斜面，用无菌水配制，特别注意要无菌操作，不要污染；
二、微生物保藏
3.明胶颗粒保藏技术
操作步骤要点
明胶颗粒制备：混合菌时的温度非常关键，不能过热，把菌烫死，温度太低，会导致颗粒凝固不好；
硅胶管准备：尽量防止硅胶吸潮，确保硅胶颗粒和玻璃棉不被污染，整个操作要求在超净台上进行；
保藏：明胶颗粒放到玻璃棉上，4℃低温保藏；
定期检查：查看保藏的菌种，如出现硅胶颜色变化失效，要及时处理；
二、微生物保藏
4.菌种复壮技术
流程
待复壮的菌种→活化→菌悬液制备→涂布平板→菌落形态鉴别→选种保藏→生产性状测定→选优保藏
操作步骤要点
活化：与斜面菌种保藏一致；
菌悬液制备：与明胶颗粒保藏法一致；
涂布平板：无菌操作，移取0.1ml到平板，培养；
二、微生物保藏
4.菌种复壮技术
操作步骤要点
菌落形态鉴别：根据菌落特征选出性状优良的单菌落，转接于试管斜面，培养；
选种保藏：选择优质试管斜面进行保藏；
生产性状测定：对保存下来的菌种进行测定，达标的且性状稳定的保存下来，不达标的淘汰；
选优保藏：把菌落特征、生产性状稳定的优秀菌种，进行保藏，也就完成了复壮菌种的筛选和保存，定期观察。
微生物接种、培养技术实训
一、材料准备
二、人员组织
三、操作步骤
四、注意事项
五、评价与考核
任务实施
大肠杆菌菌种试管、根霉试管菌种、接种环、接种铲、超净工作台、酒精灯、75%酒精、纱布、备用的试管斜面、备用的平板、接种工具支架等。
一、材料准备
将人员按照2人组成1个小组，使用1台超净台，到超净台上接种，反复练习技能，接种后接种人员轮流，每天早晚各一次观察培养情况。
二、人员组织
1、准备工作：超净台、接种工具、超净台常规、人员准备；
2、大肠杆菌接种：用接种环接种；
3、根霉接种：用接种铲接种；
4、培养观察：记录、观察、拍照；
三、操作步骤
1、接种工具一定要灭菌彻底，防止污染，培养过程中也要注意无菌操作。
2、细菌收获一般在生长旺盛时期，真菌一般在产生大量成熟的孢子之后再收集。
3、接种后的接种工具应及时消毒后存放，接种的工作台和无菌室也应进行消毒，保持洁净。放置培养箱的培养室也应定期消毒，防止污染。
四、注意事项
五、评价与考核
考核内容 考核标准 分值 小组互评 教师评价
准备工作 物品准备齐全，人员安排合理 10
接种准备 接种工具、培养基、菌种试管等摆放合理，超净工作台按规范要求开启，操作者消毒充分。 25
大肠杆菌的接种 接种方法正确，无菌操作规范。 25
根霉的接种 接种方法正确，无菌操作规范。 25
培养观察 定时观察，记录全面。 15
总分 100
斜面低温保藏技术实训
一、材料准备
二、人员组织
三、操作步骤
四、注意事项
五、评价与考核
任务实施
培养后的优良试管菌种、冰箱、待接试管斜面、超净台等。
一、材料准备
将人员分为菌种保藏观察组、保藏菌种活化组，定期观察保藏的菌种和活化菌种。
二、人员组织
1、菌种保藏及观察：将培养好的菌种，放置到4℃冰箱中，每隔15天观察一次，记录菌苔、试管内培养基形态、有无污染等情况。
2、菌种活化：分别对保藏1个月、2个月、3个月的菌种，进行移接菌种，并加以培养，对培养后的菌苔进行观察，评价保藏的效果、判定保藏的菌种是否老化。
三、操作步骤
1、注意定期对保藏设备进行消毒。
2、要定期对保藏的菌种进行检查，提出不合格和污染的菌种。
四、注意事项
五、评价与考核
考核内容 考核标准 分值 小组互评 教师评价
准备工作 物品准备齐全，人员安排合理 10
培养保藏及观察 保藏方法正确，定期观察，记录清晰、全面 40
菌种活化 按要求进行菌种活化、培养，合理评保藏效果 50
总分 100
1.简述固体基料培养技术路线。
2.简述斜面低温保藏技术操作步骤。
3.简述4℃斜面菌种保藏的注意事项。
4.撰写实训报告。
任务反思
谢谢聆听！

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