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总大肠菌群的测定
——多管发酵法
一 预备知识
总大肠菌群是指那些能37℃48h之内发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。
粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力等与肠道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。
一 预备知识
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要适用于杂质较少的水样，操作简单快速。
多管发酵法是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。
一 预备知识
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显阳性又显阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
二 实训准备
准备事宜 名 称 方 法
样品的采集和保存 　 水样采集在经灭菌的玻璃瓶内，要尽快分析，一般不宜超过2h，否则应4℃保存，可保存12h。
准备事宜 名 称 方 法
实训试剂 水 蒸馏水或纯水。
乳糖蛋白胨培养液 成分：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，乳糖5g，氯化钠5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml。
制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
二 实训准备
准备事宜 名 称 方 法
　 　 　 实训试剂 　 三倍乳糖蛋白胨培养液 按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。
伊红美蓝培养基 成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾（K2HPO42.0g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，2%伊红水溶液20ml，0.5%美蓝水溶液13ml。
制法：
①贮备培养基：先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热融化，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min。贮存于冷暗处备用。
②平板培养基：将贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及0.5%美蓝水溶液加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。当混合好的培养基冷至45℃，便立即适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。
二 实训准备
三 分析步骤
生活饮用水
饮用水源水和较清洁的地表水
严重污染的
地表水和废水
在二个装有已灭菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml
将水样作1︰10稀释
于各装有5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加10ml水样
初发酵试验的接种水样应作1︰10，1︰100，1︰1000或更高的稀释
在10支装有已灭菌的5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作各加入充分混匀的水样10ml
于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的10个试管中（内有倒管），其中5管各加入1ml水样，另5管各加入1 ml1︰10稀释的水样
于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的15个试管中（内有倒管），其中5管各加入1 ml1︰10稀释的水样，5管各加入1 ml1︰100稀释的水样，5管各加入1 ml1︰100稀释的水样
初发酵试验
三 分析步骤
各管（瓶）混匀后置于37℃恒温箱培养24h
经初发酵试验培养24h后，将产酸产气及只产酸发酵试管，分别用接种环划线接种于伊红美蓝培养基上
置37℃恒温箱内培养18~24h
挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。
①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色，中心色较深的菌落。
平板分离
三 分析步骤
涂片镜检菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，挑选该菌落另一部分接种于普通浓度蛋白胨培养液中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1~3个。
置于37℃恒温箱中培养24h。
有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
根据阳性管（瓶）数，按粪大肠菌群的方法报告每升水样中总大肠菌群数。
复发酵试验
三 分析步骤
样品编号 接种水量（ml） 初发酵时水样呈阳性数 复发酵时水样呈阳性数 MPN值 （个/100ml） 总大肠菌群 （个/L） 备注









分析人 校对人 审核人
三 分析步骤

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