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第3章 第2节
基因工程的基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）
从社会中来
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
【培育转基因抗虫棉的简要过程】
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
（核心步骤）
1、目的基因
（1）概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物 等的基因。
（2）作用:根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要指编码蛋白质的基因。
（3）实例:与生物抗逆性相关的基因
与生物药物相关的基因
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
第一步
目的基因的筛选与获取
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白的抗虫原理：
思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌半孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破环鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
培育转基因抗虫棉用到的目的基因
Bt 抗虫蛋白基因
简称 Bt 基因
（1） 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因
是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
01
目的基因的筛选与获取
第一步
目的基因的筛选与获取
2、筛选合适的目的基因
（2） 较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（3）认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、
序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
01
目的基因的筛选与获取
第一步
目的基因的筛选与获取
2、筛选合适的目的基因
（1）人工合成目的基因
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。
DNA合成仪
转基因抗虫棉
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪用化学方法直接自动合成。
3．目的基因获取的方法
第一步
目的基因的筛选与获取
3．目的基因获取的方法
第一步
目的基因的筛选与获取
（2） 通过构建基因文库来获取目的基因
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因文库：
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克
隆群体。
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的
克隆群体。
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
基因文库的构建
限制酶
与载体连接 导入
基因组文库
基因组文库
某生物某个时期的mRNA
cDNA（互补DNA）
逆转录
受体菌群体
与载体连接 导入
部分基因文库
（如：cDNA文库）
基因文库的构建
cDNA文库
【说明】基因文库中不是直接储存相应基因，而是保存受体菌，受体菌中含有基因。
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
第一步
目的基因的筛选与获取
（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3．目的基因获取的方法
概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据________________的原理，在体外提供______________的各种组分与反应条件，对_____________________进行大量复制的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
参与DNA复制
目的基因的核苷酸序列
PCR扩增仪
①
②【重温】DNA复制的过程
解旋
合成子链
形成新DNA
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
解旋
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
合成子链
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
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C
G
A
G
C
T
T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
DNA聚合酶形成磷酸二酯键
子链延伸合成的方向？
只能从5′－端→3′－端延伸
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
重新螺旋形成新的DNA分子
复制特点：
①边解旋边复制 ②半保留复制
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
复制原则：
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
(Taq酶）
人工合成的引物
（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如能量、缓冲液等
②PCR和DNA的体内复制是否完全相同？
PCR技术所需
条件
耐高温的DNA聚合酶
DNA模板
引物
缓冲溶液
四种脱氧核苷酸
微量离心管
（dNTP）
（2种）
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
（一般添加Mg2+）
PCR的条件：
目的基因DNA(模板)、四种游离的脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、一定的缓冲溶液(维持反应体系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性） 控制温度变化
根据体内DNA复制所需的基本条件及基本过程，阅读P77最后一自然段以及P78-79的图3-5和有关文字，总结PCR技术所需的条件和基本过程。
引物是一小段能与________的一段碱基序列________的___________。
用于PCR的引物有 种，长度通常为20~30个核苷酸。
DNA母链
互补配对
短单链核酸
2
第一步
目的基因的筛选与获取
前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物
（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物结合在
模板链的3’端
3′
5′
子链的延伸方向是5 ′→3 ′？
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
子链
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端
子链合成需要引物？
第一步
目的基因的筛选与获取
（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
①变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
③延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
引物
DNA模板
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
PCR反应的过程
PCR扩增仪
③
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
③PCR反应的过程
1）变性：
当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
90℃
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
2）复性：
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。
碱基互补配对
3）延伸：
当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
72℃
思考：为什么温度要上升至72℃？
思考：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
第二轮循环的产物
第三轮的产物
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
第一轮循环的产物
3’
5’
3’
5’
④PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
思考
获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？
至少要三次循环。
第一轮产生的子链长度小于模板链长度，到第三轮循环时，才出现2个两条脱氧核苷酸链等于目的基因。
扩增次数 第1次 第2次 第3次 第n次
DNA分子数
含引物A(或B) 的DNA分子数
同时含引物A、B的DNA分子数
共消耗的 引物数量
2
2
0
4
6
8
14
2
6
2n
2n+1-2个
2n-2
1
3
7
2n-1
⑤PCR扩增DNA规律
2n－1对
复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，
原因是：
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之问的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
思考
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
【补充】基因的结构
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
基因通常是有遗传效应的DNA片段
能编码特定的蛋白质
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA进一步编码（翻译）
出蛋白质的DNA区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的、不间隔的
非编码区：
含有能调控遗传信息表达的DNA序列
不转录，不编码蛋白质
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
间隔的、不连续的
外显子：
内含子：
数量关系：外显子=内含子 + 1
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列
转录
初级RNA
成熟mRNA
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？
剪切、拼接
DNA聚合酶
单链DNA
cDNA
逆转录酶
逆转录
复制
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
(1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因( )
(2)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。( )
(3)PCR的每一个循环都包括变性→复性→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。( )
×
×
√
【基础过关】
【当堂训练】
关于PCR技术的说法不正确的是(　 　)
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温的酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和四种核糖核苷酸
D
下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是(　　)
D
A.①过程所需的原料是核糖核苷酸
B.②过程所需的酶必须耐高温
C.③过程需要解旋酶破坏氢键
D.④过程的引物对之间不能互补配对
获取了足够量的目的基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使基因能够表达和发挥作用。能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？
构建基因表达载体（核心工作）
基因表达载体由哪些部分组成
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
1.构建基因表达载体的目的：
2.基因表达载体的组成
思考：要各个元件有什么作用？
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
01
目的基因的筛选与获取
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状，必须插到启动子
和终止子之间
启动子：
本质：有特殊序列结构的DNA片段
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识
别和结合的部位，驱
动基因转录出mRNA
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
本质：有特殊序列结构的DNA片段
位置：基因的下游
功能：终止转录
四环素抗性基因、荧光蛋白基因等
标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
载体≠表达载体：
1.二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
2.表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
【区分两组概念】
特殊序列结构的DNA片段
位于mRNA上
翻译的起始点
翻译的终点
转录的起始点
转录的终点
本身不转录
决定氨基酸
不决定氨基酸
基因表达载体
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
3.基因表达载体的构建过程
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
①首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
②然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
载体
载体（质粒）
DNA分子（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
培育抗虫棉的简要过程
使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解决这一问题？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，
防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选。若被破坏，无法进一步筛选。
思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？
请结合下图，回答问题：
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能，有何弊端？
能
①质粒、目的基因会发生自身环化连接；
②会发生两两自身连接；
③质粒与目的基因会发生反向连接。
思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？
请结合下图，回答问题：
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？
请结合下图，回答问题：
【核心归纳】图解限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因原则：
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
（3）确保出现相同黏性末端原则：
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？
可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
（4）保证目的基因和质粒发生定向连接
难点剖析
1.前面说用应该同一种限制酶切割载体和目的基因，现在又说应该用不同的限制酶切割载体和目的基因，两种说法是否冲突？
不冲突，用不同的酶是指不管是切割载体还是切割目的基因，最好都用两种限制酶切，保证不管是载体还是目的基因，其本身左右两侧的切口不同，不会自身环化。
而为了保证目的基因和载体能连接，就要求不管目的基因用的什么种类的限制酶切，载体也应该用同一种限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，则载体也应该用酶1和酶2切。
难点剖析
2.目的基因应该插入到载体的哪个部位？如果目的基因插入到标记基因或复制原点中，该基因表达载体还能用么？如何避免这种现象？
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，才能保证目的基因的正常转录。
（2）目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等各个结构都不得含有限制酶识别序列，否则会影响表达载体的构建。
（1）基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 （　 　）
（2）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子 （　 　）
（3）标记基因不一定是抗生素抗性基因 （　 　）
（4）当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因
的表达（　 　）
课堂练习
2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 (　 　)
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
课堂练习
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
问题思考
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
第三步
将目的基因导入受体细胞
（常用）
基因枪法
（单子叶植物常用）
②在植物授粉后一定时间内，剪去 ，将DNA溶液滴在 ，使目的基因通过 进入 。
①用微量注射器将 溶液直接注入 中；
花粉管通道法导入外源DNA
适用生物：开花植物
（1）花粉管通道法（我国独创）
1.目的基因导入植物细胞
含目的基因DNA
子房
柱头
花柱切面
花粉管通道
胚囊
第三步
将目的基因导入受体细胞
实例：
我国“转基因抗虫棉”
优缺点：
简便经济（优点）
要求花朵较大（缺点）
①转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
（2）农杆菌转化法
1.目的基因导入植物细胞
第三步
将目的基因导入受体细胞
②原理：
①农杆菌能在自然条件下侵染 植物和 植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。
双子叶
裸子
Ti质粒
T-DNA
染色体DNA
可转移的DNA
（可转移的DNA）
③方法：
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等，
1.目的基因导入植物细胞
第三步
将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化法
目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达④过程：第三步将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中重组DNA转入农杆菌农杆菌侵入植物将目的基因带入植物细胞含外源目的基因的重组DNA整合到植物细胞的基因组中目的基因遗传特性稳定维持和表达 1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养
第三步
将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化法
该过程经过____次拼接、____次导入
①第一次拼接：_______________________________
②第二次拼接： _______________________________
_______________________________
③第一次导入：__________________________________
④第二次导入：__________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
农杆菌将含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
拓展—拼接&导入
（1）导入方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
①体积大，易操作。
②易表现出全能性。
（3）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
第三步
将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
（移植到同期发情的母畜子宫内）
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
知识拓展
病毒介导法（主要用于导入动物细胞）
第三步
将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
Ca2+处理
原核细胞（常选择大肠杆菌）
（2）受体细胞：
Ca2+
感受态细胞
吸收
第三步
将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
优点：
繁殖周期短 体积小易于培养操作
多为单细胞 遗传物质相对较少
使用Ca2+处理：
增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）
小结：将目的基因导入受体细胞的方法
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法
受体 细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
问题思考
在抗虫棉的培育过程中，目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
PCR等技术检测
抗原 — 抗体杂交技术
分子
水平
抗虫鉴定
（个体水平）
第四步
目的基因的检测与鉴定
(1)分子检测
(2)个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
第四步
目的基因的检测与鉴定
1.目的:
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
2.概念
（1）借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传
（2）基因探针：
一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。
（3）核酸杂交：
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，
如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
第四步
目的基因的检测与鉴定
3.检测内容及方法:
（一）分子水平的检测
检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
①检测目的基因是否导入
——方法1：通过PCR等技术检测
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
DNA半保留复制
第四步
目的基因的检测与鉴定
基本思路：
①制作基因探针，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
探针与受体中的DNA分子杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已插入
未插入
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
第四步
目的基因的检测与鉴定
——方法2：DNA分子交杂技术
变性
1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针；
2、使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，则导入成功。
原理：碱基互补配对原则
①检测目的基因是否导入
检测Bt基因是否翻译出mRNA
提取棉花细胞mRNA
逆转录
产生DNA
对扩增产物进行检测
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
②检测目的基因是否转录
——方法1；通过PCR等技术检测
（一）分子水平的检测
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
第四步
目的基因的检测与鉴定
②检测目的基因是否转录
——方法2：分子杂交技术
1、制作基因探针；
2、探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了mRNA。
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
杂交分子
（可检测）
原理：碱基互补配对原则
第四步
目的基因的检测与鉴定
③检测目的基因是否翻译
——通过抗原-抗体杂交检测
从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
抗原
抗体
杂交
脱分化
第四步
目的基因的检测与鉴定
从棉花中
提取蛋白质
用相应抗体进行
抗原-抗体杂交检测
检测目的基因是否表现出相应的性状
检测抗虫棉是否具有抗虫性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
（二）个体水平的检测
第四步
目的基因的检测与鉴定
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上 是否插入了目的基因 PCR扩增
DNA分子杂交技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR扩增
分子杂交技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平 鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测， 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
课堂小结
基因工程的基本操作程序
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
琼脂糖凝胶电泳
思考：如何对PCR扩增的产物进行鉴定？
1、实验原理
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些_______ 会向着________________ 的电极移动，这个过程就是_____。
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定
琼脂糖凝胶电泳
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
染色
300nm
紫外灯
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关。
凝胶的浓度
DNA分子的大小
构象
DNA片段的扩增及电泳鉴定
2、材料用具
PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1gp～1μg ①加液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
（1）DNA片段的扩增
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
（2）DNA片段的电泳鉴定
①配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
②制备凝胶
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
③加样
：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
④电泳：
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑤观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察
和照相
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）DNA片段的电泳鉴定
注意:
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4.结果分析与评价
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
【三点提醒】
①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。
因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
练习与应用
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
D
练习与应用
一、概念检测
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。

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