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第一章：发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
第一课时 微生物的基本培养技术
教学目标
01
生命观念：
掌握通过配制培养基，了解配制培养基的基本步骤，以及培养基中各类营养物质的配比。
02
科学探究：
通过对酵母菌进行纯培养，理解并掌握微生物接种、分离和培养的基本原理和过程。
03
科学思维：
通过对培养皿和培养基进行灭菌，了解消毒和灭菌的原理及方法。
04
社会责任：
关注食品安全和健康的生活方式。
社会责任：
关注食品安全和健康的生活方式。
请将下列生物按照结构组成进行分类：
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
真菌：酵母菌、青霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
微生物的类群
病毒：新冠病毒等RNA病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌:蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌:链霉菌等
微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称。本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。
思考：怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
防止杂菌污染，获得纯净微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
从社会中来：
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
实验室培养微生物的条件:
(1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
(2）确保其它微生物无法混入
(3)并将需要的微生物分离出来
思考：如何获得纯净微生物呢？
培养基
无菌技术
纯化培养
1.定义：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3.种类：
有无 凝固剂琼脂
液体培养基、固体培养基
微生物的分离、
鉴定、活菌计数
扩大培养、
工业生产
（1）按物理性质分
一、培养基的配制
液体培养基
固体培养基
（2）按用途分
选择培养基、鉴别培养基
（3）按化学性质分
天然培养基、合成培养基
划分 培养基种类 特点 用途
物理 性质
化学 成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
补充：培养基的类型及用途
半固体培养基
资料1：100g马铃薯中含有80g水、2g蛋白质、16g碳水化合物，还有无机盐等。
资料2：下表为1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
培养基组分 提供的主要营养
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
Nacl 5g
H2O 定容至1000ml
水
碳源、磷酸盐和维生素等
氮源和维生素等
无机盐
思考：比较上述两种培养基的成分共同点，说出培养基的必备营养成分有哪些？
牛肉膏
蛋白胨
一、培养基的配制
成分 含义 来源 功能
碳源 提供碳元素的物质
氮源 提供氮元素的物质
水 生物体内含量最多的化合物
无机盐 提供除碳、氮以外的元素，包括大量元素和微量元素
自养微生物
异养微生物
4.培养基的营养成分：
（1）一般都含有碳源、氮源、水、无机盐
一、培养基的配制
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-等含碳无机物
有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、牛肉膏和蛋白胨等
①构成细胞物质和一些代谢产物；
②有机碳既是碳源又是能源
无机氮源：N2、NH3，氨盐、硝酸盐等
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
将无机氮合成含氮的代谢产物
合成蛋白质、核酸和含氮的代谢废物
牛肉膏、蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质
外界摄入(培养基、代谢产物)
①良好的溶剂，参与化学反应；
②维持生物大分子结构的稳定
无机化合物：
①提供无机营养；
②调节培养基的pH；
③维持渗透压
4.培养基的营养成分：
（2）特殊条件：
pH、O2和特殊营养物质
例： 1.培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；
2.培养霉菌时，需要将培养基调制酸性；
3.培养细菌时，需要将培养基调制中性或弱碱性；
4.培养厌氧微生物时，需要提供无氧条件
生长因子、氨基酸、维生素、碱基等
一、培养基的配制
1.为什么培养基需要氮源？
是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
不一定。例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中的氮气。
2.培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术应围绕着如何避免杂菌污染展开。主要包括消毒和灭菌。
二、无菌技术
P10旁栏思考2：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
有效避免操作者自身被微生物感染。
1.消毒和灭菌工作主要包括两方面：
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
注意事项：
实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
有效避免操作者自身被微生物感染。
比较项目 消毒 灭菌
概念 使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
作用强度 较为温和的理化因素 强烈的物理、化学因素
作用程度 杀死物体表面或内部的部分微生物 杀死物体内外所有的微生物
芽孢和孢子 消灭部分芽孢 能杀灭全部芽孢和孢子
适用对象 操作空间、活体生物材料、操作者的衣着和双手 操作工具、玻璃器皿、培养基等
消毒和灭菌的原理都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。但两者的实质不同。消毒的结果实际上是部分灭菌。
2.消毒与灭菌的概念及区别：
二、无菌技术
知识拓展
芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜(如温度、水分适宜)的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。
孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
芽 孢 和 孢 子
芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体(不是繁殖体)，叫作芽孢。
3.常用的消毒与灭菌的方法
(1)消毒的主要方法及应用范围
方法 适用范围 操作方法
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药剂消毒法
紫外线消毒
日常生活用品(家庭餐具)
100℃煮沸5～6 min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
不耐高温的液体(牛奶、啤酒、果酒和酱油等)
62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min,可以杀死绝大多数微生物，不破坏营养成分
生物活体(皮肤、伤口、动植物组织表面消毒)、水源、手术器械、塑料或玻璃器皿等
体积分数为70%-75%的酒精擦拭双手、用氯气消毒水源，碘酒皮肤伤口，石炭酸等
房间、仪器设备(接种箱、接种室、超净工作台)
紫外线照射30 min
相关信息：生物消毒法
3.常用的消毒与灭菌的方法
(2)灭菌的主要方法及应用范围
方法 适用范围 操作方法
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
高压蒸汽灭菌锅:压力100kPa、温度121℃下维持15-30min
培养基、无菌水等多种器材
物品放入干热灭菌箱，160～170℃的热空气中维持2～3 h
耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿)、金属用具 (如针头、 镊子、剪刀等)等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层(外焰)灼烧，可以迅速彻底地灭菌。
适用于微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具，试管口、瓶口等容易被污染的部位
1.灭菌物品不要装得太挤，以妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果
注意事项
2.锥形瓶和试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包裹的瓶口的纸渗入棉塞
3.加热初期打开排气阀，待冷空气排尽之后再关闭
4.断开电源，让锅内温度自然下降，待压力表指针指到零后打开排气阀
湿热灭菌
二、无菌技术
3.常用的消毒与灭菌的方法
(2)灭菌的主要方法及应用范围
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
灼烧灭菌
化学药物消毒（酒精）
紫外线消毒
巴氏消毒法
以下所采用的灭菌或消毒方法依次是
化学药物消毒（次氯酸钠）
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
有活性生物材料
二、无菌技术
1、培养物
2、纯培养物
3.纯培养
（一）培养物、纯培养物、纯培养概念辨析：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
微生物群
分散
单个细胞
单个菌落
繁殖
获得纯培养物的过程就是纯培养。
三、微生物的纯培养
（二）纯培养的步骤：
配制培养基
倒平板
接种和分离
培养
灭菌
固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
(1)菌落：
1.实验原理
稀释涂布平板法、平板划线法。
大小、形状、隆起程度、颜色等。
鉴定菌种的重要依据
探究 实践：酵母菌的纯培养
三、微生物的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
(2)单菌落：一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
（3）特征：
（4）功能：
(5)获得单菌落的方法：
酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。
2.目的要求
3.材料用具
(1)学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
(2)学会进行无菌操作。
(3)尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
探究 实践：酵母菌的纯培养
三、微生物的纯培养
4.方法步骤
配制
培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。
倒平板
待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
(1)制备培养基
培养酵母菌
制备培养基
接种和分离
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
避免杂菌污染。
倒平板
倒平板注意事项：
温度：50℃左右
冷凝后平板倒置
操作：在酒精灯火焰附近
4.方法步骤
通过灼烧灭菌，防止瓶口微生物污染培养基
不要完全打开，以免杂菌污染培养基
防止培养基表面的水分过度挥发;防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
思考：1.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
2.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在
（2）.接种和分离酵母菌
平板划线法
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
探究 实践：酵母菌的纯培养
三、微生物的纯培养
4.方法步骤
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灼烧灭菌，待冷却后再开始画线
④划线后,培养皿倒置培养
【平板划线法注意事项】
（2）.接种和分离酵母菌
4.方法步骤
平板划线法
接种前，杀死接种环上的微生物，避免污染培养基
杀死残留菌种，确保每次划线菌种来自上次划线的末端
......
划线结束后，杀死残留菌种，避免环境污染和感染操作者
以免接种环温度太高，杀死菌种。
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
将接种后的平板
未接种的平板
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染.
探究 实践：酵母菌的纯培养
三、微生物的纯培养
4.方法步骤
（3）.培养酵母菌
划3个平板(重复实验)和1个不划线(空白对照)
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
(2)在未接种的培养基表面是否有菌落生长 如果有,说明了什么
5.实验结果分析与评价
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加。
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
(3)在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落 这些菌落的颜色、形状和大小是否一致 如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗
(4)你是如何记录实验结果的 请与其他同学交流、互评。
①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落
(1)为什么划线时要注意不能划破培养基？
思维训练：评估论点的可信程度
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
水果“酵素”是什么？
其制作原理是什么？
其中可能含有哪些成分？
其是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？
其中的所有成分都有益于人体健康吗？
“酵素”就是“酶”的另一种说法。
其制作是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。
其中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分。
不存在它独有的、特殊的营养物质。
其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制——降低食品的水分含量；
腌制——通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温储存——通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
练习与应用：
3.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作；可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
练习与应用：
4. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。
练习与应用：

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