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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
从社会中来
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术。
失败
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
酸奶
①制作工具和原料灭菌
②接种单一的菌种
③控制发酵条件
④避免杂菌进入
第1课时 微生物的基本培养技术
1. 微生物的概念：微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称，包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
微生物的类群
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌:蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌:链霉菌等
本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
_____________， 是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
防止杂菌污染
获得纯净的微生物培养物
微生物的基本培养技术
难以用肉眼观察到的微生物该如何培养呢？
01 培养基的配制
实验室培养微生物的条件
(1)要为人们需要的微生物提供合适的___________条件。
(2)要确保 ，并将需要的微生物分离出来。
——培养基
——无菌技术
营养和环境
其他微生物无法混入
1.培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3.培养基的类型:
(1)按物理性质：液体培养基、固体培养基。
(2)按化学组成：天然培养基、合成培养基。
(3)按目的用途：选择培养基、鉴别培养基。
微生物的分离、鉴定、活菌计数
固体培养基
液体培养基
扩大培养、工业生产
有无 凝固剂琼脂
半固体培养基
观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基：呈固体状态的培养基。
①液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基是实验室最常用的培养基之一。
②微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
注意：凝固剂（如琼脂），不能被微生物利用，只起到凝固作用。
液体培养基
琼脂固体培养基
加入琼脂
1. 定义：单个或少数同种菌体在固体培养基上大量繁殖，形成肉眼可见的子细胞群体。
2. 特征：形状、大小、颜色、光泽度、透明度等。
3. 功能：菌落是鉴定菌种的重要依据。
知识补充：菌落
沙门氏菌
毛霉
青霉菌
酵母菌
一个菌落就是一个种群
强调：不同种类微生物的菌落特征各有特点,但彼此之间存在一定的相似性;同种微生物的菌落特征受培养时间、营养物质的含量与种类等影响也会有所差异。
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
目的用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
【注意】病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活，目前不能利用人工培养基来培养。
混合样品
选择培养基上部分菌种才能生长
普通培养基上所有菌种都能生长
选择培养基
鉴别培养基
目的菌
目的菌周围出现特殊现象
非目的菌
非目的菌周围无明显现象
培养基中加氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基+氨苄青霉素
培养基
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
3. 培养基的营养构成
注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
（1）一般都含有碳源、氮源、水、无机盐
碳源
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等
自养微生物
异养微生物
功能：①构成细胞物质和一些代谢产物②有机碳既是碳源又是能源。
氮源
无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等。
注：含C、H、O、N的有机物尿素[CO(NH2)2]除外是异养型微生物的碳源、氮源、能源。
无机盐
功能：提供无机营养
调剂PH
维持渗透压
水
功能：良好的溶剂
维持生物大分子结构的稳定
思考：为什么培养基需要氮源？
氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质必须的元素。
微生物的化学组成大体相同，主要由C、H、O、N、P、S等大量元素和Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo等微量元素组成，这些元素最终来自外界环境中的各种有机物和无机物。
思考：为什么各种培养基的具体配方不同，但一般都有水、无机盐、碳源和氮源？
思考：培养微生物时，培养基中是否必须添加碳源和氮源？并说明理由。
例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空气中的氮气。
（2）培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ；
②培养霉菌时，需要将培养基调至 ；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
3. 培养基的营养构成
主要指生长因子（微生物生长所必须的、微量的、自身不能合成或合成很少的有机物）
种类：维生素、氨基酸、碱基、嘌呤、嘧啶、胺类等
来源：酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等
物质 来源 功能
碳源 无机碳源 CO2、NaHCO3等含碳无机物 ①构成细胞物质和一些代谢产物；
②有机碳既是碳源又是能源
有机碳源 糖类、脂质、蛋白质、有机酸等 氮源 无机氮源 N2、NH3、铵盐、硝酸盐等 将无机氮合成含氮的代谢产物
有机氮源 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
水 外界摄入 ①良好的溶剂；
②维持生物大分子结构的稳定
无机盐 无机物（Ca、K 、Mg等大量元素 Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素） 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素
生长因子 维生素、氨基酸、碱基 ①酶和核酸的组成成分；
②参与代谢过程中的酶促反应
3. 培养基的营养构成
二、无菌技术
1.无菌技术的对象：
（1）实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
（2）培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
注意：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。为了避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
2. 无菌技术的类型
（1）消毒
①概念：使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
②适用对象：对操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
（2）灭菌
①概念：使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
②适用对象：用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
-----与消毒最本质区别
芽孢指某些细菌（如芽孢杆菌等）在一定条件下细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。如某些细菌的芽孢煮沸3小时才死亡。每个细菌仅形成一个芽孢。
孢子指细菌、真菌、原生动物和植物等产生的一种有繁殖作用的生殖细胞。正常情况下不需要两两结合就可以由单个细胞直接发育成新个体。
知识拓展
3.常用的消毒和灭菌方法类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物。强烈的理化方法，杀死所有微生物。煮沸消毒家庭餐具等生活用品100℃煮沸5～6min巴氏消毒牛奶等不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体（皮肤、伤口）、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基及多种器材和物品高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121 ℃,15～30min接种室、接种箱，超净工作台（迅速彻底）4. 防止杂菌污染的措施
（1）实验前：
①对操作空间、操作人员消毒；
②对所用器皿、接种用具和培养基灭菌。
①避免已灭菌处理材料用具与周围物品接触造成污染；
②为避免周围微生物污染，实验操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
（2）操作时：
（3）实验后：
使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
思考：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
还能有效避免操作者自身被微生物感染。
实战演练：
（1）培养基用什么方法灭菌？
（2）培养皿用什么方法灭菌？
（3）实验操作者的双手用什么方法消毒？
（4）接种环用什么方法灭菌？
（5）实验室用什么方法消毒？
（6）为保证无杂菌，实验操作都要在哪里进行？
（7）牛奶用什么消毒？
灼烧灭菌
超净工作台的酒精灯火焰旁
巴氏消毒法
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
化学药物消毒（酒精）
紫外线消毒
微生物的纯培养
1
2
3
4
5
（一）相关概念
纯培养物
培养物
纯培养
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体
获得纯培养物的过程
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
纯培养的步骤：
（二）酵母菌的纯培养
不同菌落的大小、形状、光泽度、颜色等不同。
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
微生物群
分散或稀释
单个细胞
繁殖
单菌落
酵母菌菌落：
湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚。
（二）酵母菌的纯培养
目的要求
1.学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
2.学会进行无菌操作。
3.尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
材料用具
酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。
（二）酵母菌的纯培养
1.制备培养基
称取去皮的马铃薯200g
切成小块
加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂
用纱布过滤
滤液中加入20g葡萄糖，15~20g琼脂
用蒸馏水定容至1000mL
得到滤液
(1).配制培养基：
（二）酵母菌的纯培养
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞
包上牛皮纸，并用皮筋勒紧
压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15 ~ 30min
取5 ~ 8套培养皿
培养皿叠成一束
用几层牛皮纸包紧
放入干热灭菌箱内，160 ~ 170℃灭菌2h
(2)灭菌：
1.制备培养基
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
(3)倒平板：
倒平板注意事项：
温度：50℃左右
冷凝后平板倒置
操作：在酒精灯火焰附近
1.制备培养基
实验注意事项
1.培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？
2.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？
3.倒平板时为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
4.在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
琼脂是一种多糖，在44℃以下凝固，倒平板时，若低于50℃不及时操作，琼脂会凝固。
避免杂菌污染
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
不能；因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
5.为什么倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能完全打开？
6.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
7.怎么确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？
防止杂菌污染培养基
可避免培养基中的水分过快蒸发；可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
平板划线法
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
2.接种和分离酵母菌：
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
1
2
3
4
5
连续划线法
分区划线法
平板划线法注意事项
（1）接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
（2）划线首尾不能相接
（3）每次划线前灼烧接种环进行灭菌
（4）划线操作结束后，仍需灼烧接种环
平板划线法
2.接种和分离酵母菌：
在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
第二次及以后的划线时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
思考 · 讨论
为什么不能将最后一次的划线与第一次的划线相连？
将聚集的菌种逐步稀释，以便获得单菌落。
线条末端酵母菌的数目比起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到单菌落。
菌种经数次划线后培养，分离得到单菌落。
第一次划线酵母菌数量多，最后一次划线酵母菌数量少，首尾相连，不容易得到单个菌落。
思考 · 讨论
划五次线，接种环需要灼烧几次？
1
2
3
4
5
第1次划线
接种环灭菌
第2次划线
接种环灭菌
第3次划线
接种前接种环灭菌
接种环灭菌
第4次划线
接种环灭菌
第5次划线
接种环灭菌
需要灼烧6次。
1
1
2
3
接种前，杀死接种环上的微生物，避免污染培养基
2
杀死残留菌种，确保每次划线菌种来自上次划线的末端
3
划线结束后，杀死残留菌种，避免环境污染和感染操作者
接种环三个不同时期灼烧的目的
划线前
划线时
划线后
平板划线法
2.接种和分离酵母菌：
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
2.培养酵母菌：
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
未接种的培养基是不能有菌生长的，如果有菌生长，则说明受到污染或者灭菌不彻底。
正确的做法是，配好培养基之后，将培养基放在温箱里培养24小时观察，长菌的培养基应该丢弃，无菌生长的方能使用。这样做的另一个好处是将培养基水蒸发干，不会对微生物的培养产生影响。
1. 在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
2. 如果你观察到了不同形态的菌落，你认为可能是由哪些原因引起的？
可能是接种的菌种不纯、培养基灭菌不彻底，或接种过程中感染了杂菌。
结果分析与评价（p13）
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用（p14）
一、概念检测
练习与应用（p14）
2. 日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制—降低食品的水分含量；
腌制—通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温储存—通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
一、概念检测
二、拓展应用
1. 某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有 。
培养皿和培养基
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
接种
练习与应用（p14）
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
二、拓展应用
1. 某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
练习与应用（p14）
2. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
二、拓展应用
意味着培养液中O2含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论？其原因是什么
培养液中O2含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。

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