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真题测评·试能力
1．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、
酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基
因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和
质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。
限制酶的切割位点如图所示。
专题9 生物技术与工程
(二) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　 )
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
答案：C
解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coli DNA连接酶无法连接酶3切出的平末端，A不符合题意；
用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意；
质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；
酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。
2．(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用 含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　 )
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案：D
解析：若用Hind Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；
若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
DNA凝胶电泳技术可分离大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，不能在含Tet(四环素)的培养基中形成菌落，D错误。
3．(2023·全国乙卷，节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指____________________________________。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是____________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是______________________________。
解析：(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
(2)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。
答案：(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因　(2)终止子　启动子　被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录　鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来
4．(2023·山东高考)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是____________________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________________________(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的__________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
解析：(1)与启动子结合的酶是RNA聚合酶，图中甲有启动子和终止子等，质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。
(2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链，而根据图甲中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′。由于DNA复制的方向是子链的5′→3′，所以引物的延伸方向为5′→3′，引物结合的单链其方向是3′→5′，故与引物F1配对的单链是b链，与引物F1相应的部分序列相同的是a链。
(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检测出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
答案：(1)RNA聚合酶　限制酶切割位点、标记基因、复制原点等　(2)F1和R2(或F2和R1)　a链　(3)J-V5融合蛋白　不是
深化学习·提素养
1．限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
续表
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙)
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
(3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
2．基因表达载体的构建过程(如图)
[典例]　(2023·天津二模)人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。如图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的过程，图中Tetr表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示，请回答以下问题：
限制酶名称 识别序列和 限制酶 识别序列和
切割位点 名称 切割位点
BamHⅠ HaeⅢ
Bcl Ⅰ Sau3AⅠ
Not Ⅰ
(1)①过程常采用的方法是______________。
(2)要将人乳铁蛋白基因插入质粒，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是______________，构建基因表达载体时，需要将人乳铁蛋白基因嵌入到__________________之间，这样人乳铁蛋白基因才能在乳腺细胞中表达。
(3)据图分析筛选含有重组质粒的受体细胞首先需要在含______________(填“四环素”“氨苄青霉素”或“四环素和氨苄青霉素”)的培养基上进行。
(4)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为__________，对于该部位，这两种酶__________(填“都不能”或“只有一种能”)切开。
[解析]　(1)将目的基因导入动物受精卵常采用的方法是显微注射法。
(2)根据表中五种酶的识别序列及切割位点可知，限制酶Sau3AⅠ还可以切割限制酶BclⅠ和限制酶BamHⅠ的识别序列，因此要将人乳铁蛋白基因插入载体，在只允许用一种限制酶切割载体和人乳铁蛋白基因的情况下，应选择限制酶Sau3AⅠ。构建基因表达载体时，需要将人乳铁蛋白基因嵌入到启动子和终止子之间，这样人乳铁蛋白基因才能在乳腺细胞中表达。
(3)用限制酶Sau3AⅠ切割后会破坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此筛选成功导入重组质粒的受体细胞可在含有氨苄青霉素的培养基上进行。
(4)根据表格中各种限制酶的识别序列和切割位点可知，若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接起来，则这两种酶都不能切开，连接部位的6个碱基对序列见答案。
[易错提醒]
(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。
(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。　　　　
考法训练·融会通
考法(一)　限制酶的选取
1．下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断下列说法错误的是(　 )
注：Y＝C或T，R＝A或G
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案：D　
解析： HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；
Sau3AⅠ限制酶识别—GATC—序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；
由题表可知，BamHⅠ和Sau3A Ⅰ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端，C正确；
一种限制酶也可以识别多种核苷酸序列，如HindⅡ能识别—GTYRAC—序列，其中Y可以是C或T，R可以是A或G，D错误。
2．(2023·朝阳二模)为初步探究某动物phb2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1kb＝1 000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。图1为所用载体图谱示意图，phb2基因序列不含图1中限制酶的识别序列。转化后的大肠杆菌提取质粒，再用选中的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2。下列叙述错误的是(　 )
A．需设计特异性的引物通过PCR技术扩增phb2基因
B．为使phb2基因与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ两种不同限制酶的识别序列
C．经过两种限制酶酶切的phb2基因与载体进行连接时，可选用T4 DNA连接酶
D．图2中3号的质粒很可能是含目的基因的重组质粒
答案：B
解析：通过PCR技术扩增phb2基因时需根据phb2基因设计特异性结合的引物，A正确；
目的基因应导入启动子和终止子之间，由图1可知，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于限制酶KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以为使目的基因与载体正确连接，应在扩增的目的基因两端分别引入EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列，B错误；
T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链 DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，可以用T4 DNA连接酶连接酶切后的目的基因与载体，C正确；
题干显示，目的基因(phb2基因)大小为0.9 kb，图2中3号的质粒经酶切后得到大小约6 kb的片段和约1 kb的片段，大小约1 kb的片段很可能是增加了限制酶识别序列的目的基因，D正确。
考法(二)　基因表达载体的构建
3．甲型流感病毒的抗原性与感染性与其表面的R蛋白(血凝素蛋白)密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。下列相关叙述错误的是(　 )
A．电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定
B．图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶
C．通过PCR技术从1个cDNA分子中特异性扩增出R蛋白基因，要得到24个不含黏性末端的R蛋白基因至少需要5次循环
D．构建好的重组质粒长度共2 000 bp，据图乙可推测BamHⅠ在重组质粒上有3个酶切位点
答案：C
解析：相同限制酶对不同生物的DNA或同种生物不同个体的DNA切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定，A正确；
图甲为获得重组质粒过程，需要逆转录、形成双链cDNA分子以及R蛋白基因与质粒的重组，所以至少需要应用到逆转录酶、DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶，B正确；
通过PCR技术将cDNA分子扩增成双链DNA后，若要从中特异性扩增出完整的R蛋白基因，循环3次可获得2个不含黏性末端的R蛋白基因，循环4次可获得8个不含黏性末端的R蛋白基因，循环5次可获得22个不含黏性末端的R蛋白基因，C错误；
由图乙可知，用Hind Ⅲ将长度为2000 bp的重组质粒切割后形成的3个片段的长度分别约为200 bp、400 bp和1 400 bp，说明Hind Ⅲ在(环状)重组质粒上有3个酶切位点，而用Hind Ⅲ和BamHⅠ将重组质粒切割后形成了长度约为200 bp、420 bp、560 bp的片段，2 000＝420×2＋560＋200×3，所以一共形成了6个片段，因此共有6个酶切位点，而限制酶Hind Ⅲ与BamHⅠ识别序列不相同，因此BamH Ⅰ在重组质粒上有6－3＝3(个)酶切位点，D正确。
4．自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列相关叙述错误的是(　 )
A．上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因
B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
D．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上
答案：B
解析：蓝色玫瑰细胞质基质中的靛蓝能够稳定显色是由基因控制的，不受pH的影响，故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因，A正确；
将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，则会将终止子1一同切除，故只能用限制酶BamH Ⅰ，B错误；
sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，C正确；
将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法，农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到受体细胞(白玫瑰细胞)染色体DNA上，D正确。
5．(2023·石家庄二模)单宁酶可水解单宁酸为没食子酸，降低茶汤中单宁酸含量，解决茶饮料“冷后浑”问题和果汁类饮料除涩问题。我国科学家在土壤中筛选出分泌单宁酶的黑曲霉Lys117，利用基因工程对其进行改造，提取单宁酶基因与强表达组件(强表达启动子和信号肽基因)结合，最终实现单宁酶的高产。回答下列问题：
(1)单宁酶基因扩增及组装如图所示：P1左侧有RNA聚合酶识别和结合的位点，为实现单宁酶基因与强表达组件定向连接，PCR扩增设计引物时需对引物添加相应的限制酶识别序列。则PCR应选择的引物对为______________，在各引物前添加的识别序列对应的限制酶分别是________________。
(2)与强表达组件结合后的基因与Ti质粒重组：该过程为基因工程的核心步骤，即________________________。已知信号肽负责把蛋白质引导到不同的具膜细胞器内，本实验中信号肽基因存在的意义为______________________________________________。
(3)重组Ti质粒导入目的菌并检测：将重组Ti质粒用特定方法导入黑曲霉Lys117，记为Lys117＋，可依据______________，最终鉴定出高产单宁酶的黑曲霉。
解析：(1)PCR技术的原理为DNA半保留复制，子链延伸方向为5′端→3′端，结合图示，故应选择引物P2与P3；分析题图可知，BamHⅠ能识别目的基因中的核苷酸序列，破坏目的基因的完整性，不能选择该酶，而在载体上存在EcoRⅠ、Sau3AⅠ、EcoRⅤ三种限制酶的酶切位点，为了保证表达载体中信号肽的正常存在，考虑选择EcoRⅠ、Sau3AⅠ，
而根据图中所给各种限制酶识别序列及切割位点可知：Sau3AⅠ限制酶也能将BamHⅠ识别的序列切割，故不可选用Sau3AⅠ限制酶，只能用BglⅠ来取代Sau3AⅠ，它与Sau3AⅠ能切割出相同末端，不影响表达载体的构建，故应分别选用BglⅠ与EcoRⅠ这两种限制酶进行切割。
(2)基因工程基本操作步骤，需要经历四步：目的基因获取→基因表达载体的构建→目的基因导入受体细胞→目的基因检测与鉴定，其中基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤；根据题干“已知信号肽负责把蛋白质引导到不同的具膜细胞器内”可推测，本实验中信号肽基因存在的意义为信号肽基因表达的信号肽会引导肽链转移到内质网继续合成与加工，利于单宁酶的正常合成与分泌。
(3)本实验的目的是筛选出高产单宁酶的黑曲霉，因此可以依据Lys117＋中单宁酶表达量的高低来筛选出高产菌株。
答案：(1)P2与P3　EcoRⅠ、BglⅠ　(2)基因表达载体的构建　信号肽基因表达的信号肽会引导肽链转移到内质网继续合成与加工，利于单宁酶的正常合成与分泌　(3)Lys117＋中单宁酶表达量的高低

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