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第37讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
[课标 要求] 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
3.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。
4.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。
5.举例说出日常生活中的转基因产品及影响；中国禁止生殖性克隆人；举例说明生物武器对人类的威胁与伤害。
6.活动：DNA的粗提取与鉴定。
7.活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
8.活动：搜集文献资料，就“转基因食品是否安全”展开辩论。
9.活动：搜集“转基因食品是否安全”及关于设计试管婴儿的资料。
构思维导图
基因工程的基本操作程序
DNA片段的扩增与电泳鉴定
考点一
重组DNA技术的基本工具
目
录
CONTENTS
考点二
考点三
重温高考 真题演练
考点四
生物技术的安全性与伦理问题
考点五
基因工程的应用
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
操作对象及环境
操作水平
操作原理
结果
生物体外
基因
DNA分子水平
按照人类的需要定向改造生物的遗传特性
基因重组（不同物种间）
优点：
能克服远缘杂交不亲和的障碍；
定向改造生物的遗传特性。
基因工程的概念
基因工程得以实现的理论基础是？
拓展
基因工程的理论基础
1
限制酶
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
考点一、重组DNA技术的基本工具
平末端:限制酶在识别序列的中心轴线处切开时形成的。
黏性末端:限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的。
中轴线
中轴线
EcoRⅠ限制酶
SmaⅠ限制酶
识别序列为GAATTC,
切割位点在A和G之间。
识别序列为CCCGGG,
切割位点在C和G之间。
【重点难点·透析】
限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。
(3)确保目的基因和载体出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶。
一个基因从DNA分子上切下来，需要切 处，产生 个黏性末端，断 个磷酸二酯键，需要 个水。
2
4
4
4
2
DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
分子缝合针
　与DNA有关的几种酶的比较
[归纳拓展]
酶种类 作用底物 作用部位 作用结果
限制酶 DNA分子 将DNA切成两个或多个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端
解旋酶 DNA分子 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
DNA水解酶 DNA分子 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
DNA分子片段
脱氧核苷酸
碱基对中的氢键
磷酸二酯键
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
⑵种类：
思考题：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，
其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
⑴作用：
①携带外源DNA片段进入受体细胞
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
3
基因进入受体细胞的载体
环状双链DNA分子
⑶载体需具备的条件
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
3
基因进入受体细胞的载体
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示　限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(1)质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点）
① 。
② 。
③ 。
(2)质粒 （是/不是）一种细胞器。
(3)细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别
①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是物质，如 ；也可是生物，如 ；也可是λ噬菌体的衍生物。
②功能不同：细胞膜上的载体功能 ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 。
化学本质和结构相同
能够自我复制
具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等
不是
蛋白质
质粒
动植物病毒
协助细胞膜控制物质进出细胞
目的基因导入受体细胞
【总结】易错点拨
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
基因工程的实现需要解决哪些问题？
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
如何筛选和获取？
为何要拼接？如何拼接？
需要什么工具？
将目的基因导入不同生物细胞的方法
重组DNA分子需具备哪些条件？
目的基因一定能进入受体细胞吗？进入后一定能表达吗？
考点二、基因工程的基本操作程序
①逆转录法：
②化学合成法：
1
目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变_____________或获得____
_________等的基因。主要是指___________的基因。
②筛选目的基因的方法：从相关的__________和____________的基因中进行筛选。______________和序列比对工具的应用。
受体细胞性状
预期
表达产物
编码蛋白质
人工合成目的基因
通过构建基因文库来获取目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
已知结构
功能清晰
序列数据库
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸dNTP
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
变性 复性 延伸
条件
引物的作用：
94℃左右
55℃左右
72℃左右
使DNA聚合酶能够从引物
的3’端开始连接脱氧核苷酸
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①原理： 。
②扩增过程
DNA复制
③过程
目的基因DNA________后_______，____与单链相应________结合；然后以_______为模板在________作用下进行_____，即将4种_________加到__________，如此___________。
受热变性
解为单链
引物
延伸
互补序列
单链DNA
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
重复循环多次
（1）变性
①温度：_____________
②具体变化： ________________
上升到90℃以上
双链DNA解旋为单链
（2）复性
①温度：_____________
②具体变化: ___________________
_______________________________
下降到50℃左右
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
（3）延伸
①温度：_____________
②具体变化： _____ ____ _
_______________________________
上升到72℃左右
4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
①n代后，DNA分子有_____个
②n代后，DNA链有_____条
③第____代出现完整的目的基因
④n代后，含引物的DNA分子有_____个
⑤n代后，共消耗_____个引物
⑥第n代复制，消耗了______个引物
⑦n代后，完整的目的基因有_____个
2n
2n+1
3
2n
2n+1-2
2n
2n-2n
第一代
第二代
第三代
第四代
第五代
易错提醒
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　　　　的原料，又可为DNA的合成提供　　。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　　，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。
DNA子链
能量
RNA单链
引物
Mg2＋
Mg2＋
PCR技术和DNA复制的比较
如何对PCR产物进行检测鉴定？
琼脂糖凝胶电泳
易错提醒
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律
PCR技术和DNA复制的比较
需要引物的原因？
DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。
①1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出 个DNA片段，共需要引物数量为 。　　　
②1个模板DNA分子经过 轮PCR，可以扩增出仅含引物之间的片段。　　　
2n
2n＋1－2
3
(1)PCR原理：利用了_____________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够_______________的仪器。
DNA的热变性
1
实验基础
DNA片段的扩增及电泳鉴定
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、________________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
(2)DNA片段电泳鉴定的原理：
自动调控温度
2
PCR实验操作步骤
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为_________的__________下被检测出来。
3
DNA的测定：
300 nm
紫外灯
PCR技术和DNA复制的比较
思考：通过PCR技术扩增目的基因，与体内DNA复制相比，主要优点是什么？
不需解旋酶、可在短时间内大量扩增目的基因（高效快速）、易于操作
考向2　围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查社会责任
2．(2022·福建龙岩一中)VNN1基因(1 542bp)与炎症相关性疾病有关，GFP基因(4 735bp)控制绿色荧光蛋白的合成，该蛋白可在相应波长的紫外光激发下发出绿色荧光。某研究小组进行鼠源GFP VNN1重组质粒的构建及其功能研究，回答下列问题：
(1)为构建重组质粒，研究小组从数据库查找到VNN1的DNA序列，并设计引物。上游引物：
5′ AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC 3′(下划线为HindⅢ酶切位点)，下游引物：
5′ GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA 3′(下划线为Bam HⅠ酶切位点)，之后进行PCR扩增，PCR的原理是______________________。扩增后的VNN1基因要与含GFP基因的载体连接，需用____________________(填具体酶)切割VNN1基因和含GFP基因的载体，再用____________处理，构建重组质粒。
DNA双链复制
HindⅢ酶和BamHⅠ酶
DNA连接酶
(2)GFP基因在重组质粒中的作用是_________________________________________
_______________________________________________________________________。
用之前相同的限制酶对GFP VNN1重组质粒切割后，进行电泳鉴定时得到如图1所示的部分条带，结果表明_________________________________________________
_______________________________________________________________________。
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来
VNN1基因已经插入到含GFP基因的载体中
(3)IL 6为体内重要的炎症因子，能与相应的受体结合，激活炎症反应。图2为GFP VNN1重组质粒对细胞分泌IL 6的影响，由此说明______________________
______________________________________________________________________；同时发现与正常组比较，空质粒转染组IL 6的表达有轻微升高，造成这种现象的可能原因是________________________________________________________。
VNN1基因表达产物能促进细胞分泌炎症因子IL 6
操作过程中对细胞的损伤(或用到化学试剂对细胞具有一定的毒性作用)，可以激活相应细胞分泌炎症因子IL 6
① ;
② 。
启动子：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。
终止子：
终止转录
⑴目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
⑵组成
标记基因：
目的基因：
复制原点：
鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞
目的基因必须插入到 与 之间。
终止子
DNA复制的起始位点。
启动子
2
基因表达载体的构建
---基因工程的核心
(3)基因表达载体的构建过程
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
问题：该过程需要用到基因工程哪些工具？
载体与基因表达载体的区别：
二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。基因表达载体在载体基础上增加了启动子、目的基因、终止子。
载体
自身环化
片段间
的连接
目的基因自身环化
质粒自身环化
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接
目的基因
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2’
1’
2
1
如何解决这一问题？
单酶切缺点：
思考：如果用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接
双酶切！
反向连接
问题探讨：
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
如何筛选出插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落？
在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，产生一些菌落，然后将这些菌落按照原来的位置转移到含有四环素的培养基上进行培养，一段时间后，某些菌落将会出现停止增殖的现象，这些菌落的位置在含氨苄青霉素的培养基中对应的位置的菌落即为插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落。
知识拓展
标记基因的作用
注：Amp R：氨苄青霉素抗性基因，Tet R：四环素抗性基因
易错提醒
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 ______ _____ _______ _______
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 ________________________________________________ ____________________________ ___________________________ _____________________________
DNA
DNA
mRNA
mRNA
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
3
将目的基因导入受体细胞
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 农杆菌转化法、_____ _________ 显微注射法 　　　处理法
受体细胞 ________________ _______ 原核细胞
转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
花粉
受精卵
Ca2＋
管通道法
体细胞或受精卵
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建
表达载体
导入
植物细胞
插入
植物细胞染色DNA
表达
新性状
导入
农杆菌
第一次拼接
第二次拼接
第一次导入
第二次导入
T—DNA
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持__________
的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是　　　　。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
稳定和表达
基因重组
T－DNA
染色体DNA
农杆菌
受体细胞
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的　　　　上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的　　　　　　上；
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入　　　，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入　　　　。
(3)农杆菌特点
①能在自然条件下侵染　　　　　和　　　　，而对大多数___________
没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有　　　，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
Ti质粒
①常用法: .
②常用菌： 。
③微生物作为受体细胞的原因是 。
④过程：
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
Ca2+处理法(感受态细胞法)
大肠杆菌
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
⑤受体细胞用Ca2+处理的目的是 。
⑥用Ca2+处理受体细胞是通过改变 的通透性来完成
使其变为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子
细胞壁
注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
将目的基因导入微生物细胞
4
目的基因的检测与鉴定
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步
第二步
第三步
个体水平鉴定
转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出mRNA
目的基因是否翻译形成蛋白质
PCR等技术
PCR等技术
抗原-抗体杂交技术
抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测；
基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
目的:检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
①制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
②提取受体细胞全部DNA或mRNA，与基因探针置于同一培养液。
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
核酸分子杂交技术
转基因生
物的DNA
探针
15N
变性
15N
杂交DNA分子（可检测）
变性
若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
抗原-抗体杂交技术
考向1　围绕基因工程的基本工具，考查科学思维
1．(2022·揭阳普宁二中)2020年诺贝尔化学奖被授予“CRISPR/Cas9基因编辑技术”的发明者，以表彰他们在基因组编辑领域的贡献。CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如下图)。回答下列问题：
(1)CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是__________________________________
_______________________________________________________________________，
Cas9蛋白催化断裂的化学键位于______________之间。若采用基因工程的方法获得Cas9蛋白，构建重组质粒需要的酶是__________________________。
(2)一般来说，在使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和________(填“相同”或“不同”)的sgRNA进行基因的相关编辑。
(3)若将CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是_______________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
(4)通过上述介绍，你认为CRISPR/Cas9基因编辑技术在________________________
_________________________________________ (写出2点)等方面有广阔的应用前景。
与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA
磷酸和脱氧核糖
限制酶和DNA连接酶
不同
避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题
基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能
2．(2022·辽宁东北育才学校)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。下图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列分析不正确的是(　　)
A．第一阶段过程中的产物是依赖引物1、引物2和引物3、引物4扩增的结果
B．引物2和引物3上均含有与模板链不能互补的碱基
C．PCR过程中需要先加热至90 ℃以上后再冷却至72 ℃左右
D．第三阶段需要利用引物1和引物4获得目的基因
C
3．(2022·浙江卷改编)截至2022年10月，我国在抗击新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻，尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。
(1)新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
(2)接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是_________________________
_______________________________________________________________________。
逆转录
核酸探针
抗原
载体
使腺病毒失去复制能力
(3)单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________________。
脾
动物血清
考向3　结合基因工程的操作程序及其应用，考查科学探究
4．(2022·浙江温州)土壤农杆菌介导转基因植物的培育过程中，为了便于受体细胞的筛选，常将土壤农杆菌中的Ti质粒进行改造，并加入卡那霉素抗性基因(KanR)和β 半乳糖苷酶基因(lacZ′)，如图所示。β 半乳糖苷酶能催化特殊物质X gal发生显色反应而使固体培养基上含该基因的菌落呈蓝色，否则呈白色。
回答下列问题：
(1)用BseYⅠ切割质粒和含有目的基因的DNA，在DNA连接酶的作用下__________(填“能”或“否”)形成重组质粒，理由是________________________
_______________________________________________________________________。
(2)为便于筛选，需将农杆菌接种在含______________、X gal的LB培养基，以去除未转化的细胞，再选择______色菌落，即为所需菌落。这一过程中，切割含目的基因的DNA片段，应选择限制性内切核酸酶________，用于导入重组质粒的农杆菌本身________(填“含”或“不含”)lacZ′基因。
(3)为提高重组质粒导入农杆菌的效率，除考虑导入方法、筛选条件、防止污染外，还需考虑的主要因素有___________________________________________________
________________________________________________________ (答出2点即可)。
能
具有互补的黏性末端
卡那霉素
白色
BglⅡ
不含
农杆菌的感受态、数量(密度)；质粒的大小、质量、浓度、纯度；无机盐浓度
2.实验原理：
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
1.实验设计思路：
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
考点三、DNA的粗提取与鉴定
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
3.选材：
注意：
4.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
——析出DNA
——溶解DNA
——鉴定DNA，要现配现用
家用洗洁精含有SDS；洗衣粉含有蛋白酶和表面活性剂，可裂解细胞膜、使蛋白质变性。
冷酒精析出DNA
DNA的鉴定（沸水浴、二苯胺）
研磨
称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
纱布过滤取上清液
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
5.实验步骤：
DNA的鉴定
1号试管 2号试管
加入2mol/L NaCl溶液 5mL 5mL
丝状物(DNA) 不加 加入
用玻璃棒搅拌 无 丝状物溶解
加入二苯胺试剂 4mL 4mL
沸水浴 5min 5min
观察现象 不变蓝 变蓝
鉴定结果
①以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
②利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
③加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。
④加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
⑤预冷的酒精具有以下优点：a.可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；b.抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；c.低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
注意事项
考向1　结合DNA的粗提取和鉴定，考查科学探究
1．(2022·广东大湾区联合模拟)在DNA指纹技术研究中认为，DNA中的高度重复序列具有高度可变性，但其高度重复序列中有一小段序列在所有个体中都一样，称为“核心序列”。下图是某刑事案例中女受害者、受害者体内精液和三位怀疑对象的DNA指纹图谱，请根据以上内容和指纹图谱回答下列问题：
(1)指纹图谱就是把“核心序列”串联起来作为探针，与不同个体的DNA进行__________________就会出现各自特有DNA指纹图谱。应用DNA指纹技术，首先需要用____________将待测的样品DNA切成片段，然后用电泳的方法将这些片段按大小分开。
(2)提取动物细胞的DNA时需先破碎细胞，常用的方法是________________。为了纯化提取的DNA，可利用DNA在____________中溶解度的不同来去除杂质。在沸水浴的条件下，DNA遇____________会变成蓝色。
(3)一滴血、精液或是一根头发中的DNA虽然含量很少，但仍可以进行DNA指纹鉴定，因为在鉴定之前可通过______________获得大量的相同DNA。从上图可以判断出怀疑对象中____________最可能是罪犯。
DNA分子杂交
限制酶
吸水涨破法
NaC1溶液
二苯胺
PCR技术
1
考点四 基因工程的应用
1.基因工程在农牧业方面的应用
抗虫功
能的基因
抗
病基因
降解或抵抗
1.基因工程在农牧业方面的应用
蛋白质编
码基因
花青素代谢相关的基因
外源生长激素基因
乳糖酶基因
乳汁
2.基因工程在医药卫生领域的应用
基因改造
显
微注射
抗原决定基因
克隆
免疫排斥
目的基因（药用蛋白基因）的筛选与获取
乳腺蛋白基因的启动子等调控组件
基因表达载体
显微注射法
受精卵
早期胚胎培养
早期胚胎
胚胎移植
母体动物
转基因动物，通过分泌乳汁获得所需要的药物
构建
发育
实例1.乳房（乳腺）生物反应器：
2.基因工程在医药卫生领域的应用
胚胎移植前，应取样滋养层，做DNA分析，鉴定性别，保留雌性
思考题：
1.为什么要将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？
让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达
2.目的基因可在乳腺细胞中表达，其他组织细胞中含有该目的基因吗？ 。理由是： 。
含有
因为它们都是由同一个受精卵分裂、分化而来的
目的基因（药用蛋白基因）的筛选与获取
乳腺蛋白基因的启动子等调控组件
基因表达载体
显微注射法
受精卵
早期胚胎培养
早期胚胎
胚胎移植
母体动物
转基因动物，通过分泌乳汁获得所需要的药物
构建
发育
实例1.乳房（乳腺）生物反应器：
2.基因工程在医药卫生领域的应用
思考题：
3.利用乳腺生物反应器生产蛋白质，有什么局限性？
受性别和发育时期的限制
4.如何改进？
将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组，制备膀胱生物反应器，从尿液中提取。
不受性别和发育时期的限制
目的基因（药用蛋白基因）的筛选与获取
乳腺蛋白基因的启动子等调控组件
基因表达载体
显微注射法
受精卵
早期胚胎培养
早期胚胎
胚胎移植
母体动物
转基因动物，通过分泌乳汁获得所需要的药物
构建
发育
实例1.乳房（乳腺）生物反应器：
2.基因工程在医药卫生领域的应用
思考题：
5.乳腺生物反应器的含义是什么？
乳腺生物反应器指整个转基因动物，而不是转基因动物的乳腺
6.乳腺生物反应器经有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？？
不一定；
①目的基因在受体细胞中不是成对存在的，相当于杂合子，配子中可能不含该基因，则有性生殖产生的后代中可能不含目的基因
②有性生殖产生的后代可能为雄性，不能分泌乳汁
2.基因工程在医药卫生领域的应用
实例2.用基因工程菌生产药物：（如细胞因子、抗体、疫苗、激素等）
⑵.用大肠杆菌生产人胰岛素的流程：
⑴.工程菌：
用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类称为基因工程菌
①人胰岛素基因的筛选和获取：用RT-PCR（逆转录PCR）获取人胰岛素基因（cDNA）
②人胰岛素基因表达载体的建构：用限制酶和DNA连接酶将人胰岛素基因（要添加启动子、终止子）与质粒拼接，构建基因表达载体；
③将人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞：用Ca+处理大肠杆菌，将重组质粒导入大肠杆菌；
④人胰岛素基因的检测与鉴定：检测筛选出成功转化的大肠杆菌
⑤进行发酵培养（菌种扩大培养、配置培养基、灭菌、接种、发酵、产物的分离和提纯）
思考：目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？
大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的胰岛素肽链进行加工，没有生物活性;
酵母菌是真核生物，有内质网和高尔基体，可以对合成的胰岛素肽链进行一定的加工和修饰，有生物活性。
乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容 乳腺生物反应器 工程菌
含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物受精卵 微生物细胞
目的基因导入方式 显微注射法 感受态细胞法
生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取
(3)用转基因动物做器官移植的供体
①供体动物： 。
②存在难题：存在 反应。
③解决办法：将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制
的表达，或设法除去 ，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
猪
免疫排斥
2.基因工程在医药卫生领域的应用
抗原决定基因
抗原决定基因
①猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似
②与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得多
思考题：为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？
工程菌
牛凝乳酶的基因
基因
工程菌
3.基因工程在食品工业方面的应用
考向1　结合基因工程的应用，考查社会责任
1．(2022·辽宁沈阳二中)2020年8月16日，由我国军事医学研究院陈薇院士团队及康希诺生物联合申报的腺病毒载体新冠疫苗被授予专利权，这是我国首个新冠疫苗专利。全面接种新冠疫苗，建立免疫屏障，可有效防止新冠病毒大规模传染。请据题意并结合图1、图2回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，通过其表面的S蛋白与宿主细胞膜表面ACE2受体结合而完成感染。研制疫苗时，通过RT PCR(逆转录—聚合酶链式反应)获取S蛋白基因所需要的酶是______________________________________。据图1分析，应选择的引物是________，其作用是在酶的催化下能从引物的________端开始连接脱氧核苷酸。
(2)PCR的产物一般通过________________来鉴定，结果如图2所示。1号泳道为标准(Marker)，2号泳道为阳性对照(提纯的S蛋白基因片段)，3号泳道为实验组。标准(Marker)的实质为不同__________的DNA片段混合物，3号泳道若有杂带出现原因一般可能是____________________________________________________________
_______________________________________________________________________
(至少答出2点)。
逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶　
Ⅱ、Ⅲ
3′
琼脂糖凝胶电泳
已知长度
模板受到污染；引物的特异性不强；退火温度偏低
(3)腺病毒是一种DNA病毒，该病毒基因组中表达出的E1区蛋白与腺病毒的复制有关而且对宿主细胞的毒性很强。为了提高疫苗的________，避免人体因重组腺病毒增殖而感染，科研中将____________构建的复制缺陷型腺病毒作为运载S蛋白基因的载体制备新冠疫苗。
安全性
去除E1基因
蛋白质工程
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
①基础：___________________________________
②操作：___________________________________
③操作对象：_______________________________
④目的：___________________________________
⑤地位：___________________________________
⑥理论和技术：_____________________________
⑦ 人类蛋白质组计划
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
改造或合成基因
改造现有或制造新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求
在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
基因
分子生物学、晶体学和计算机技术
蛋白质
（三维结构）
预期功能
生物功能
翻译
折叠
行使
转录
设计
推测
改造或合成
mRNA
目的基因
2. 基本思路
预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）
通过 或 ，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。
基因修饰
基因合成
3. 手段
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系
基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；
②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
预期蛋白质功能
目的基因
蛋白质工程与基因工程的比较
归纳总结
4.蛋白质工程的应用
（1）研发速效胰岛素类似物
天然蛋白质易形成二聚体或六聚体
预期结构
改造
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
新胰岛素基因
转录
mRNA
折叠
预期功能
行使功能
降低胰岛素的聚合作用
设计结构
改变B链第20-29位氨基酸组成
推测序列
翻译
多肽链
有效抑制胰岛素的聚合
（2）延长干扰素体外保存时间
天然干扰素不易保存
预期结构
改造
一个半胱氨酸变成丝氨酸
新干扰素基因
转录
mRNA
折叠
预期功能
行使功能
延长保存时间
设计结构
氨基酸替换
推测序列
翻译
多肽链
在-70℃下可以保存半年
（3）降低人对小鼠单抗了抗体的免疫反应
通过_______，将小鼠抗体上_ _ ____的区域（即 ）“嫁接”到_______（即 ）上，经过这样改造的抗体_____________________________；
改造基因
结合抗原
可变区
人的抗体
恒定区
诱发免疫反应的强度就会降低很多
（4）其他
①改进酶的性能或开发新的工业用酶；
②改造某些参与调控光合作用的酶，
以提高植物光合作用的速率，增加粮食的
产量；
③改造微生物蛋白质的结构，使它防治病
虫害的效果增强；
考向2　结合蛋白质工程，考查科学思维
2．(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________________________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是________________________________________________________。
氨基酸序列多肽链
mRNA
密码子的简并性
（2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有______
__________________________、_______________________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是____________。
从基因文库中获取目的基因
通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
DNA双链复制
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是_________
_______________________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路___________________________________
_______________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
种类
提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间
1. 转基因成果
项目 成果
转基因微生物方面 ①减少啤酒酵母双乙酰的生成,缩短啤酒的发酵周期;②构建高产、优质的基因工程菌来生产________、药物
转基因动物方面 ①将生长激素基因、促生长激素释放激素基因等转入动物体内,培育了一批__________、营养品质优良的转基因家禽、家畜;②将某些抗病毒的基因导入动物体内,培育了抵抗相应病毒的动物新品种;③建立某些人类疾病的转基因动物模型
转基因植物方面 培育出了大批具有______、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状的作物
氨基酸
生长迅速
抗虫
考点五　生物技术的安全性与伦理问题
一 转基因产品的安全性
2. 理性看待转基因技术
（1） 理性看待转基因技术
① 清晰地了解转基因技术的________________。
原理和操作规程
② 看到人们的观点受到许多复杂的__________________等因素的影响。
政治、经济和文化
③ 靠确凿的______和严谨的逻辑进行思考和辩论。
证据
（2） 我国对转基因技术的方针是一贯的、明确的，就是研究上要大胆，坚持_________；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。
自主创新
对转基因产品安全性的争论
1. 关注生殖性克隆人
（1） 生殖性克隆和治疗性克隆的概念
① 生殖性克隆是指通过克隆技术产生__________的新个体。
独立生存
② 治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官,用它们来____________受损的细胞、组织和器官,从而达到治疗疾病的目的。
修复或替代
二 关注生殖性克隆人和禁止生物武器
（2） 关于生殖性克隆人的争论
赞同理由：
①科学研究有自己内在的发展规律，社会应该允许科学家研究；
②现在人们的伦理道德观念还不能接受这一切，但是__________是可以
改变的。
反对理由：
①生殖性克隆人“有违人类尊严”；
②生殖性克隆人是在人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人，
严重地违反了______________，是克隆技术的滥用；
③克隆技术还不成熟，面临着流产、死胎和畸形儿等问题。
人的观念
人类伦理道德
（3） 我国禁止生殖性克隆人
我国政府一再重申四不原则:________、不允许、不支持、不接受任何
生殖性克隆人实验。我国政府主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。
不赞成
2. 禁止生物武器
（1） 生物武器种类及特点
① 生物武器包括__________、病毒类和生化毒剂类等。
致病菌类
② 特点:____________、攻击范围广。
致病能力强
（2） 禁止生物武器:在任何情况下________、不生产、不储存生物武器,并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
不发展
1.生殖性克隆和治疗性克隆的比较
类型 生殖性克隆 治疗性克隆
目的 产生独立生存的新个体 治疗疾病
水平 个体水平 细胞水平
联系 都属于无性生殖；产生新个体或新组织，遗传信息相同
2.试管婴儿和设计试管婴儿的比较
类型 试管婴儿 设计试管婴儿
技术手段 不需进行遗传诊断 胚胎移植前需进行遗传诊断
实践应用 解决不孕不育问题 用于白血病、贫血病等疾病的治疗
联系 二者都是体外受精，经体外早期胚胎发育，再进行胚胎移植，在生殖方式上都为有性生殖
考向　结合生物技术的安全性和伦理问题，考查社会责任
1．(2022·山东济南期末改编)20世纪70年代以后，一大批生物技术成果问世，对人类的生产和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大的作用，科学家甚至利用分子遗传学等知识和技术把改造生命的幻想变成现实。但生物技术的发展在造福人类的同时也可能带来潜在的危害。下列有关生物技术的安全性与伦理问题描述正确的是(　　)
A．将目的基因导入叶绿体基因组可以有效地防止基因污染
B．经济、文化和伦理道德观念的不同不会影响人们对转基因技术的看法
C．生殖性克隆和治疗性克隆的结果本质是相同的，都会面临伦理问题
D．人体不会对转基因技术制造的具有超强的传染性和致病性的新型病原体产生免疫反应
A
2．(2022·广东连州)下列关于转基因生物与安全性的叙述，正确的是(　　)
A．转基因培育的植物，理论上目的基因只存在于特定的组织中
B．转基因技术与植物体细胞杂交技术均可打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育出杂种新物种
C．种植转基因抗虫棉时，常间行种植普通棉花以供害虫取食，其主要目的是保护物种多样性
D．转基因花粉中若有毒蛋白或过敏蛋白，则它有通过食物链传递而引发人类食品安全问题的可能
D
高考真题体验
1.(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B
2．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是____________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的__________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明_________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明__________________。
逆转录酶(反转录酶)
特异性核苷酸序列
退火(复性)
曾感染新冠病毒，已康复
已感染新冠病毒，是患者
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是___________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)
3．(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAGP和FLAGP△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是___________________________________________________
_______________________________________________________________________，
为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对
5′端
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_____________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变
在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAGP、FLAGP△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAGP和FLAGP△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是_______________________；
由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
促进UBC与FLAG P的结合
P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是_____________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
药物A促进UBC与FLAG P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的
4．(2022·广东卷)“绿水逶迤去，青山相向开”，大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
引物
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是______________________________________，终止子的作用是____________________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是______________________________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于______________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞
终止转录
,使转录在需要的地方停下来
二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长
废物的资源化
不仅不排放二氧化碳，而且可以消耗工业废气中的二氧化碳

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