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第34讲 发酵工程
课标要求 核心素养
发酵工程利用微生物的特定功能规模化生产对人类有用的产品 3.1 获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础 3.1.1 阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提 3.1.2 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术 3.1.3 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物 3.1.4 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法 3.1.5 概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法 3.2 发酵工程为人类提供多样的生物产品 3.2.1 举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的 3.2.2 阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品 3.2.3 举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值 生命观念：结合果酒、果醋、泡菜等产品的制作离不开微生物的发酵，说出发酵工程及相关技术的基本原理，通过以上事实建立结构与功能观；通过对微生物的分离和培养，建立物质与能量观。
科学思维：归纳与概括并比较果酒、果醋、泡菜的制作原理。
科学探究：针对某种发酵产品选取恰当的技术和方法，尝试提出初步的工程学构想，进行简单的设计和制作；分离土壤中分解尿素的细菌，并进行计数。
社会责任：关注食品安全，提高自身保健意识，倡导和践行健康的生活方式。
从传统发酵技术到发酵工程
科学家发现了酶在酵母菌发酵中的作用，之后微生物的分离和纯化技术得到了应用。
1897年
用微生物生产谷氨酸获得成功，酶制剂、多糖、维生素发酵工业兴起。
1957年
科学家开始运用数学、动力学、化学工程原理以及计算机技术对发酵过程进行综合研究。
20世纪80年代以后
法国微生物学家巴斯德通过实验证明酒精发酵是由活的酵母菌引起的，从而将酵母菌与发酵联系起来。
1857年
利用发酵工程大规模生产青霉素，随着链霉素、金霉素和土霉素等抗生素的发现及生产，抗生素发酵工业兴起。
20世纪40年代
基因工程。细胞工程等发展，人胰岛素和干扰素大量生产。
20世纪70年代以后
1900
1940
1960
1850
1980
1970
约9000年前
我们祖先就会利用微生物将谷物、水果发酵为含酒精的饮料。
发酵
发酵工程
发酵是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物代谢转化为人类所需的产物的过程。(P5 )
指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。 它涉及菌种的选育和培养，产物的分离和提纯等方面。（P1）
原料
人类所需产物
适宜的条件
微生物代谢
(复杂分子)
(简单分子)
蛋白质、多糖
氨基酸、抗生素
概念的区别
直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。
传统发酵技术
一　传统发酵技术的应用----尝试制作传统的发酵产品
同学们看完视频后找准每一种产品的实验原理
水果果皮表面附着的野生酵母菌
1.发酵菌种比较
需氧型
空气中的毛霉孢子
常温
15~18℃
2.发酵原理
探究 实践：制作传统发酵食品
一、制作泡菜
选择原料
配置盐水
称取食盐
修整、洗涤、晾晒、切成条状或片状
加入调味料，装坛
发酵
成品
测亚硝酸盐含量
将泡菜放入盐水中
用清水和食盐配制质量百分比为5%~20%的盐水，将盐水煮沸（目的一是除去水中的氧气；二是杀灭盐水中的杂菌），冷却代用
装坛后密封，创造无氧环境。向坛盖边缘的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境
温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。腌制过程中，亚硝酸盐的含量先增加后减少
操作步骤包括：配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色
将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用;
用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶（注意：要留有大约1/3的空间），盖好瓶盖;
将温度控制在18-30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点（注意：不是打开瓶盖），此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10-12d。可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测。
取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干;
除灰去污
避免葡萄破损，减少杂菌污染
①有氧条件，利于酵母菌快速繁殖；耗尽O2后，再进行酒精发酵；
②防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。
无需多次。防止菌种减少，影响发酵
排出CO2 ，防止爆裂
防止杂菌污染
器具消毒
冲洗葡萄
榨汁装瓶
果酒发酵
5.果酒制作步骤：
将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用;
用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶（注意：要留有大约1/3的空间），盖好瓶盖;
将温度控制在18-30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点（注意：不是打开瓶盖），此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10-12d。可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测。
取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干;
器具消毒
冲洗葡萄
榨汁装瓶
果酒发酵
果醋发酵
当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。发酵温度为30-35℃，时间为7-8d。
空气中的醋酸菌会进入果酒发酵液中大量繁殖
6.果醋制作步骤：
11
01
目的：让毛霉等产生蛋白酶和脂肪酶
目的：析出豆腐中的水分、抑制不需要的微生物生长
酒：抑制微生物生长，并使腐乳具有独特香味；
香辛料：调味，防腐杀菌
---腐乳
（3）制作过程：
直接利用原材料中的天然存在的微生物。
蛋白质
小分子肽+氨基酸
蛋白酶
脂 肪
甘油+脂肪酸
脂肪酶
【思考】每年进行同样的操作，但是每年制作的腐乳或豆瓣酱的口感都不完全相同，有些年份甚至制作不成功，你知道这是为什么吗？
提示　发酵的生产条件不易控制，容易受杂菌污染。
传统发酵技术的优点：
操作简单，适用于家庭式或作坊式生产，它是文化的传承等。
传统发酵技术的缺点：
生产条件不易控制，产品容易受杂菌污染，生产效率较低等。
（3）传统发酵技术的优缺点
13
02
进一步探究：
某同学在制作泡菜前，査阅资料得知，可以向泡菜坛中加入一些“陈泡菜水”；在用质量百分比为5%的食盐水制作泡菜时，他在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见右栏曲线图。
(1) 据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适？为什么？
发酵10天后，亚硝酸盐含量降到较低水平。
(2)他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”，造成这个结果最可能的原因是什么？
可能是食盐浓度过高、发酵温度过低等原因导致泡菜未能正常发酵。
(3) 加入“陈泡菜水”的目的是什么？
“陈泡菜水”中含有纯度较高的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种乳酸菌。
①体积分数为70%的酒精的作用：
②冲洗的目的：
③冲洗1-2次即可，能否连续冲洗，为什么：
④为什么去梗前冲洗：
⑤葡萄汁装入发酵瓶时，为何要留有1/3的空间？
⑥每隔12h左右将瓶盖拧松一点的目的：
⑦拧松但不打开的目的：
消毒
去除表面灰尘、污物
不能，防止果皮表面的野生菌种数量减少
避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会
a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后，再进行酒精发酵；
b.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出
排出气体
防止杂菌污染
3.有3位同学分别采用了3种不同的发酵装置来制作果醋。
A同学用的是带盖的塑料瓶；
B同学用了没有盖的塑料瓶，在发酵过程中无盖的瓶口一直由捆绑在瓶口的8层纱布覆盖；
C同学则设计了如右图所示的发酵装置。
结合果醋的制作原理，你认为哪一种发酵装置更适合制作果醋？你还能继续改进这种装置吗？
C同学的装置更适合制作果醋。出料口可以用来取样；充气口可以在发酵时连接充气泵进行充气，从而有利于醋酸菌更好地进行有氧呼吸，提高发酵效率；排气口可以用来排出在发酵过程中产生的气体，它通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。进一步改进：可以在充气口填充棉花或者安装其他过滤装置，以防止充入的气体携带外来杂菌污染发酵液等。
练习与应用
16
02
尝试制作传统发酵食品
-----果酒、果醋
结构 作用 酒精发酵时状态 醋酸发酵时状态
充气口
排气口
出料口
通入空气
关闭
打开，并接入气泵
排出CO2
打开
打开
便于取样监测
关闭
关闭
可以在充气口填充棉花或者安装其他过滤装置，以防止充入的气体携带外来杂菌污染发酵液等
装置改进
发酵工程
(1)概念：
利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
(2)对发酵工程概念的理解
①微生物：包括来自自然界的微生物(即“常规菌”)和基因重组的微生物(即“工程菌”)。
②产品：通过微生物的大量繁殖获得所需产品。包括利用酵母菌发酵制造的啤酒、果酒，利用乳酸菌发酵制造的酸奶，及利用工程菌生产的人胰岛素。
③实质：利用微生物进行产品生产(如次生代谢物和菌体本身)。
二、发酵工程及其应用
1.发酵工程的基本环节分析
思考：
1.工业发酵要想在较短时间内得到大量的发酵产物，则需要大量的菌体。如何得到大量菌体来缩短生产周期
2.怎样对菌种进行扩大培养？
1.需要经过多次扩大培养。
2.将培养到生长速度最快时期的菌体分开，再进行培养。
微生物分解有机物释放的能量，一部分用于合成ATP，另一部分散发到培养基中时，会引起发酵温度升高；机械搅拌也会产生一部分热量引起温度升高。此外，发酵罐壁散热，水分蒸发会带走部分热量，使发酵温度降低。
用冷却水进行温度的调节
2.啤酒的工业化流程
思考：
1.利用酵母菌进行酒精发酵为什么要“先通气后密封”？
2.啤酒生产中，发酵是重要环节，发酵后期，如果密封不严，会使啤酒变酸，你知道这是发生了什么变化吗？
3.与传统的手工发酵相比，在下面啤酒的发酵生产过程中，哪些工程手段使啤酒的产量和质量明显提高
1.“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，“密封”的目的是使酵母菌进行酒精发酵产生酒精。
2.醋酸菌是一种好氧菌，若发酵罐密封不严，酒精就会在醋酸菌的作用下被氧化产生乙醛，最后变为醋酸。
3.菌种的选育、对原材料的处理、发酵过程的控制、产品的消毒等。
具体应用 成果
食品 传统的发酵产品 酱油（霉菌）、酒类（酵母）
医药
农牧业 肥料
农药
饲料
食品添加剂
酶制剂
工程菌
改造菌种
柠檬酸（黑曲霉）、谷氨酸（谷氨酸棒状杆菌）
淀粉酶、果胶酶、脂肪酶和氨基肽酶等
生长激素释放抑制激素
青霉素
疫苗
乙型肝炎疫苗
3.发酵工程-应用
根瘤菌肥、固氮菌肥（根瘤菌和固氮菌）
多种农林虫害（苏云金杆菌）、玉米螟和
松毛虫（白僵菌）、水稻枯纹病（井冈霉素）
淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液通过发酵获得微生物菌体（单细胞蛋白）
教材延伸
1.在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长 它们会对果酒发酵产生影响吗 如果有，如何避免这种影响
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
2.某生产谷氨酸的发酵装置，在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸，但在酸性条件下则
容易形成谷氨酰胺和 乙酰谷氨酰胺，由此你可得出什么结论。__________________
__________________________________________________。
环境条件不仅影响微生物的生长繁殖，而且也会影响微生物的代谢物的形成
制作果酒的过程中，除酵母菌之外， 还会有其他杂菌生长，它们会在酒精发酵中污染发酵液，而避免发酵液污染需要从发酵制作的过程全面考虑。例如，榨汁机、发酵瓶要清洗干净；装入葡萄汁后，封闭充气口；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等
【训练2】(2021·辽宁卷)利用菠萝蜜制作果醋的大致流程为：先在灭菌的果肉匀浆
中接种酵母菌，发酵6天后，再接入活化的醋酸菌，发酵5天。下列有关叙述错误的
是( )。
A.乙醇既是醋酸发酵的底物，又可以抑制杂菌繁殖
B.酵母菌和醋酸菌均以有丝分裂的方式进行增殖
C.酵母菌和醋酸菌发酵过程中控制通气的情况不同
D.接入醋酸菌后，应适当升高发酵温度
B
[解析] 酵母菌一般以出芽（有丝分裂）的方式繁殖，醋酸菌以二分裂的方式进行增殖，B错误。
考向2 果酒和果醋的制作
【典例2】(2021·山东卷)葡萄酒的制作离不开酵母菌。下列说法错误的是( )。
A.无氧条件下酵母菌能存活但不能大量繁殖
B.自然发酵制作葡萄酒时起主要作用的菌是野生型酵母菌
C.葡萄酒的颜色是葡萄皮中的色素进入发酵液形成的
D.制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量增加
D
[解析] 制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量减少，D错误。
(2021·广东卷)中国科学家运用合成生物学方法构建了
一株嗜盐单胞菌 ，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，
含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产 等新
型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用
价值。工艺流程如图。回答下列问题：
（1）为提高菌株 对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为
__________，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培
养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用
______________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的
方法还有________________________（答出2种方法即可）等。
唯一碳源
稀释涂布平板
诱变育种、基因工程育种
（2）基于菌株 嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌
的发酵系统，其培养基盐浓度设为 ， 为10，菌株 可正常持续发酵
以上。该系统不需要灭菌的原因是__________________________________________
___________________________________________________________________。（答
出2点即可）
盐浓度为 的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡;
为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、 条件下发酵，
结果发现发酵液中菌株 细胞增殖和 产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等
物质，说明发酵条件中_____________________可能是高密度培养的限制因素。
氧气（ 或溶解氧）
（4）菌株 还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产 ，
说明其能分泌__________________________。
蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等
实验室培养微生物所需条件:
1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
2）确保其它微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
三、微生物的培养技术及应用
防止杂菌人侵，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
2.基本成分：
（一）培养基
1.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
水、碳源、氮源、无机盐,
成分 含义 作用 来源
碳源 提供碳元素的物质 构成生物体的细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质 无机碳源： 、 等
氮源 提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸等物质 无机氮源： 、 、 铵盐、硝酸盐等；有机氮源：蛋白胨等
无机盐 为微生物提供除了碳、氮之外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素 为微生物提供无机营养， 调节培养基的 等 无机化合物： 、
、 等

水 生物体含量最高的无机化合物 良好的溶剂，参与化学反 应等 培养基、代谢产物
各种培养基的配方不同，一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。例如：
3.培养基的特殊要求
牛肉膏蛋白胨培养基（基础培养基）
4.培养基分类：
标准 培养基种类 培养基特点 作用
物理性质 固体 培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，
活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂。容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、
分类鉴定
液体 培养基 不加凝固剂 常用于扩大培养，工业生产
功能 选择 培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 培养、分离出特定微生物
鉴别 培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物 鉴别不同种类微生物
成分来源 天然 培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成 培养基 培养基成分明确 分类、鉴定
类型 实例
选择培养基 培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
培养基中加入高浓度的食盐用于分离金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌
以纤维素作为唯一碳源的培养基用于分离纤维素分解菌
不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物
石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的
培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物
鉴别培养基 加入伊红-亚甲蓝可以鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)
加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌
加入刚果红可以鉴别纤维素分解菌
教材知识梳理
5.配制原则
目的要明确：
根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配置量。
营养要协调：
培养基中各营养物质的浓度和比例要适宜
碳氮比为4:1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖，谷氨酸产量少；
碳氮比为3:1时，菌体繁殖受抑制，谷氨酸合成量大增。
PH要适宜：
细菌培养基呈中性或微碱性；霉菌培养基呈酸性。
消毒
灭菌
做好消毒和灭菌工作后，要注意：
避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
获得纯净的微生物培养物的关键是
无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括
防止杂菌污染。
（二）无菌技术
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化或生物方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或
80-90 ℃煮30s-1 min
化学药物
如用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基等
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
（二）无菌技术
生物活体、水源等
可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
酒精灯外焰 充分燃烧层
（三）微生物的纯培养
34
03
鉴定菌种的重要依据：菌落特征（形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。
菌落：分散的微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部繁 殖形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物；
纯培养物、纯培养：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
2.纯培养的步骤包括
配置培养基→灭菌→接种→分离和培养
1.相关概念
平板划线法和稀释涂布平板法。
灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用
灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
培养基：用高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌培养皿：在干热灭菌箱内干热灭菌
防止污染和挥发
干热灭菌箱
高压蒸汽灭菌锅
思考：若要调节培养基的pH，应在何时进行？
判断：指示剂和染料不需要灭菌
灭菌之前
2.实例--------探究 实践：酵母菌的纯培养
制备培养基：
配制培养基
→灭菌
→倒平板
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml（定容）。
3.实例--------探究 实践：酵母菌的纯培养
制备培养基：
配制培养基
→灭菌
→倒平板
(1)灭菌：培养基应用高压蒸汽灭菌法进行灭菌；培养皿应用干热灭菌法进行灭菌。
(3)培养基冷却凝固后,将培养皿倒置,原因是防止培养基蒸发的水分落入培养基,造成培养基污染。
(2)倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近进行；倒平板时不能将培养皿完全打开,原因是防止空气中真菌的污染。
①拔出锥形瓶的棉塞。
②将瓶口迅速通过火焰。
④等待培养基冷却凝固后，将培养基到过来放置。
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿，立即盖上皿盖。
3.实例--------探究 实践：酵母菌的纯培养
接种和分离酵母菌
① 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红
② 在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。
③将试管口通过火焰。
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三到五条平行线，盖上皿盖。
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。
(4)平板划线法:通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
Q1:为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上原有微生物。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
Q2：在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
————————■链教材资料·发展科学思维■———————
？在上面的操作中思考如下几个问题
————————■链教材资料·发展科学思维■———————
Q4：平板冷凝后，要将平板倒置的原因是什么？
因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
Q5：在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养了一段时间，这样做的目的是　　　　　　　　　　　　　　。
检测培养基平板灭菌是否合格
Q3：在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。
？在上面的操作中思考如下几个问题
警示：使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
教材延伸
1.为什么培养基需要氮源？_________________________________________________
_______________________________________________________________________。
微生物细胞内有蛋白质、核酸、磷脂等多种含氮的营养物质或代谢产物，培养基中的氮源可以作为合成这些营养物质及代谢产物的原料
2.无菌技术除用来防止实验室的培养物被杂菌污染外，还有什么作用？___________
_________________________________。
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染
3.平板划线时最后一次的划线为何不能与第一次的划线相连？___________________
________________________________________________________________________
_______。
最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，若与第一次的划线相连，则增加了细菌数目，达不到纯化的目的
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板
不能用来培养微生物，原因是______________________________________________
__________________。
空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，进而造成污染
(2019·全国Ⅲ卷)回答下列与细菌培养相关的问题：
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________（填“蛋白
胨”、“葡萄糖”或“ ”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调
节培养基的 ，其原因是_______________________________。硝化细菌在没有碳
源的培养基上______（填“能够”或“不能”）生长，原因是_______________________
______________＿＿_。
蛋白胨
不同细菌生长繁殖所需的 不同
能够
硝化细菌可以利用空气中的 作为碳源
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板______（填“倒置”或“正置”）。
倒置
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜
色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是________________________________
__________________________。
在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过______处理，这种处理可以杀死丢弃
物中所有的微生物。
灭菌
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板______（填“倒置”或“正置”）。
倒置
[解析] 略。
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜
色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是________________________________
__________________________。
在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
[解析] 略。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过______处理，这种处理可以杀死丢弃
物中所有的微生物。
灭菌
[解析] 略。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
原理：
选择培养基
鉴别培养基
培养基
人为提供有利于目的菌生长的条件（营养、温度和PH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
在成分中加能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。
（三）微生物的选择培养和计数
实验室中微生物的筛选：
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
③不加含碳有机物的无碳培养基
②不加氮源的无氮培养基
①加入青霉素的培养基
高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌
1.稀释涂布平板法
①铲取土样，将样品装入纸袋中。
②将10g土样加入盛有90ml无菌水的锥形瓶，充分摇匀。将1ml上清液加入盛有9ml无菌水的试管中，依次等比稀释。
③取0.1ml 菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精烧尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
稀释涂布平板法操作示意图
1×102
1×101
1×103
拓展：平板划线法和稀释涂布平板法的比较
至少涂布3个平板，选30~300的平板取平均数
只能分离，不能对微生物计数
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
每次划线前后均需灼烧接种环（6次）
接种环在固体平板培养基表面连续划线
每毫升样品中的菌株数=(C÷V)xM
①都要用到固体培养基; ②都需进行无菌操作;
③都会在培养基表面形成单个的菌落; ④都可用于观察菌落特征
平板划线法
稀释涂布平板法
2.微生物的数量测定
（1）稀释涂布平板法
④缺点
③计算公式
②操作注意事项
①原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
a.为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
每毫升样品中的菌株数=(C÷V)xM,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL)，M代表稀释倍数。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，造成统计值比实际值偏小。
b.至少对3个平板进行重复计数，求平均值。
（2）显微镜直接计数法
③缺点：
②方法
①原理
不能区分死菌与活菌，造成统计值比实际值偏大。
细菌计数板计算、血细胞计数板。
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖。
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
根据上述实验室中微生物的筛选，设计实验选择培养土壤中分解尿素的细菌
3.探究 实践 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
实验流程：
配制以尿素为唯一氮源的培养基
样品稀释
土壤取样
倒平板
样品接种到尿素为氮源的培养基上
培养
观察与计数
菌种进一步鉴定
土壤是微生物的天然培养基。土壤微生物70%~90%为细菌，大都分布在PH中性、潮湿、距地表3~8cm的土壤中
培养皿倒置，30℃~ 37℃恒温培养24~48h
观察菌落的特征，选择菌落数目稳定时作为计数结果，防止培养时间不足所致的菌落数目遗漏
培养基中加入酚红指示剂（氨使pH升高而变红）
不用平板划线法接种，采用涂布平板操作
保证计数用平板中的菌落数在30~300之间
教材延伸
1.统计某一稀释度下平板上的菌落数的要求是_________________________________
___________________________。
统计3个菌落数在30～300的平板上的菌落数，计算菌落数的平均值
2.在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是___________________________
________________________________________________________________________
_____________________________。
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境
(2022·全国甲卷)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降
解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个
菌株的其他生理功能。实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ： ， ， ，石油。
培养基Ⅱ： ， ，石油。
操作步骤：①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液。
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。 回答下列问题：
菌株 透明圈大小
平板Ⅰ 平板Ⅱ
A +++ ++
B ++ -
（1）实验所用培养基中作为碳源的成分是______。培养基中 的作用是为
菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成_____________________（答出2
种即可）等生物大分子。
石油
DNA、RNA、蛋白质
（2）步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种 个A细菌，繁殖
代后细菌的数量是_______。

（3）为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“-”表示无透明圈），推测该同学的实验思路是
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
(2020·全国Ⅰ卷)某种物质 （一种含有C、 、 的有机物）难以降解，
会对环境造成污染，只有某些细菌能降解 。研究人员按照下图所示流程从淤泥中
分离得到能高效降解 的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分
为无机盐、水和 ，乙的组分为无机盐、水、 和 。
回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用______________的方法进行灭菌。
乙培养基中的 物质是______。甲、乙培养基均属于______培养基。
高压蒸汽灭菌
琼脂
选择
（2）实验中初步估测摇瓶 中细菌细胞数为 个 ，若要在每个平板上
涂布 稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少
应将摇瓶 中的菌液稀释_____倍。

（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的 超过某一浓度时，某菌株对 的
降解量反而下降，其原因可能是_____________________________________（答出1
点即可）。
的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
（4）若要测定淤泥中能降解 的细菌细胞数，请写出主要实验步骤______________
________________________________________________。
取淤泥加入无菌水，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培养后计数
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生
长提供4类营养物质，即________________________。
水、碳源、氮源和无机盐
绘制思维导图
1.(2022·山东卷)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细
菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生
产过程，下列说法错误的是( )。
A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B.可用深层通气液体发酵技术提高产量
C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
D
高考一遍过
2.(2022·山东卷，改编)啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸
煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法错误的是( )。
A.用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生 淀粉酶
B.焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C.糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D.通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
B
[解析] 赤霉素能促进种子的萌发，使用赤霉素处理大麦，可诱导 淀粉酶相关基
因的表达，促进 淀粉酶的合成，使大麦种子无须发芽就能产生 淀粉酶，A
正确；焙烤是为了去除大麦种子中的水分，可以杀死大麦种子的胚，但没有起到灭
菌作用，B错误。
3.(2021·浙江卷)用白萝卜制作泡菜的过程中，采用适当方法可缩短腌制时间。下列
方法中错误的是( )。
A.将白萝卜切成小块 B.向容器中通入无菌空气
C.添加已经腌制过的泡菜汁 D.用沸水短时处理白萝卜块
B
[解析] 泡菜制作所需菌种为乳酸菌，制作过程中应保持无氧环境，向容器中通入无菌空气不利于腌制，B错误。
4.(2021·北京卷)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。
下述操作不正确的是( )。
A.对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B.使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C.用取样后的棉拭子在固体培养基上涂布
D.观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
C
[解析] 取样后的棉拭子不能直接涂布，而是进行选择培养→梯度稀释→再将稀释液涂布到选择培养基上，C不正确。
5.(2022·全国乙卷)化合物 被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产
， 的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同
碳源对菌体生长和 产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重 产量
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题：
（1）通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法
有________________________（答出2点即可）。
高压蒸汽灭菌、干热灭菌
（2）由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产 的最适
碳源是__________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要__________________（答
出2点即可）等营养物质。
葡萄糖
制糖废液
氮源、无机盐、水
（3）由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是____________。
缺少淀粉酶
（4）若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产 的最适碳源浓度，某同学进行了
相关实验。请简要写出实验思路：
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基培养菌株C，
其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的 的产量，
产量最高时对应的制糖废液浓度为生产 的最适碳源浓度
（5）利用制糖废液生产 可以实现废物利用，其意义是________________________
__________（答出1点即可）。
减少污染、节省原料、降低生产成本

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