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(共37张PPT)
第2章 细胞工程
首个体细胞克隆动物
克隆动物多莉羊
体细胞克隆猴
“中中”和“华华”
如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖？
希普：首例胚胎移植成功
哈里森:首创动物组织体外培养法
张明觉：发现哺乳动物精子获能现象
格登、童第周：体细胞核移植成功
试管家兔诞生
米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
山中伸弥：获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
1996年
2006年
2014年
2017年
【科技探索之路】动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程
【从社会中来】
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
人造皮肤
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
动物细胞工程常用的技术：
——动物细胞工程的基础
动物细胞培养
动物细胞融合
动物细胞核移植等
第2节 动物细胞工程
01
动物细胞培养的条件
目录 /CONTENTS
一、动物细胞培养
01
动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养的概念
从动物体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
原理？
细胞增殖
地位？
动物细胞工程的基础
二、动物细胞培养的条件
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件。你还记得有哪些条件吗？
充足的营养
稳定的内环境
体外培养动物细胞需要满足什么条件？
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 ……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH
和渗透压
适宜的气体环境
将细胞所需的营养物质（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按种类和所需量严格配制的培养基。
1.营养条件
（1）培养基构成：
合成培养基
血清等一些天然成分
＋
合成培养基：
血清等一些天然成分：
含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质
（2）培养基类型：
液体培养基
（培养液）
血清
2.无菌、无毒的环境
（1）对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。
（2）在无菌环境下进行操作。
（3）培养液需要定期更换：
清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
另外：可根据实际情况适量添加抗生素。
无菌
无毒
3.温度、pH和渗透压
（1）适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以 为宜；
36.5±0.5℃
（2）适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为 ；
7.2-7.4
（3）适宜的渗透压：
目的 。
维持细胞正常的形态和功能
与相应动物内环境的理化性质保持一致。
强烈对比
人体内环境的理化性质
①人体细胞外液的温度一般维持在：
36.5±0.5℃
②正常人的血浆近中性，pH约为：
7.35~7.45
③渗透压：指溶液中溶质微粒对水的吸引力。
在37℃时，人的血浆渗透压约为：
770 kPa
4.气体环境
（1）气体组成及作用：
O2
CO2
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
（2）具体操作：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
CO2培养箱
01
动物细胞培养的条件
目录 /CONTENTS
一、动物细胞培养
1.取动物组织
（1）取材：
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
（2）取材原因：
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
动物相关组织的选择： 幼龄动物 or 老龄动物
2.动物组织处理——制成细胞悬液
（1）将组织分散成单个细胞
①方法：
机械法
用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
②原因：
成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖
一是能使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需要的营养供应；
（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。
二是能保证细胞内有害代谢物的及时排出。
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中进行原代培养。
【问题探究1】进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
【问题探究2】胰蛋白酶会把细胞膜蛋白分解掉吗？
可能会
控制好作用时间
3.体外培养的动物细胞类型
①悬浮生长类：
②贴壁生长类：
悬浮培养瓶
能够悬浮在培养液中生长增殖。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖。
大多数细胞属于这种类型。
表面的要求：
光滑、无毒、易于贴附。
重要概念一
①细胞贴壁：
大多数细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
一方面会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
影响贴壁类细胞生长分裂的因素？
另一方面还会发生接触抑制现象。
②接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。
肿瘤细胞
除受以上因素影响外，还会发生接触抑制现象。
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
体外培养的动物细胞
悬浮生长类
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
贴壁生长类
（大多数）
如何解决细胞分裂受阻的问题呢？
需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。
4.分瓶、进行传代培养
传代培养
（1）收集细胞
①悬浮生长类：
直接用离心法收集
②贴壁生长类：
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
（2）将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
重要概念二
①原代培养：
通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养。
②传代培养：
将分瓶后的细胞培养成为传代培养。
【思考】动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶？
第一次使用的目的是使组织细胞分散开；
贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。
动物细胞培养的过程
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
细胞贴壁
接触抑制
机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
分散成单个细胞
【问题探究3】悬浮生长细胞和贴壁生长细胞培养过程有什么不同？
悬浮生长类细胞：
原代培养→分裂受阻→离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。
贴壁生长类细胞：
原代培养→分裂受阻→先胰蛋白酶处理→再离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。
【问题探究4】动物细胞培养时，除了添加糖类、氨基酸等必要的营养成分外，往往还需添加血清等一些天然成分，原因是？
人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。
血清等一些天然成分的营养成分比较齐全，可以弥补人工培养基的不足。
【问题探究5】植物组织培养与动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理（及是否体现细胞全能性） （ 全能性）
（ 全能性）
培养基 培养基 培养基
过程 外植体 ↓脱分化 　↓再分化 芽、根或胚状体 ↓生长发育 植物体 动物的组织
　机械法↓或酶处理
细胞悬液
↓
↓
细胞悬液
↓
结果
相同点 ①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂； ②均需要无菌操作、无菌培养，需要适宜的温度、pH等条件
植物细胞的全能性
体现
细胞增殖
未体现
固体
液体
愈伤组织
原代培养
传代培养
新的植物体
新的细胞群
（1）动物细胞培养体现了动物细胞的全能性 （　 　）
（2）培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞 （　 　）
（3）悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集 （　 　）
（4）动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH （　　 ）
判断常考语句，澄清易混易错
01
动物细胞培养的条件
目录 /CONTENTS
一、动物细胞培养
动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫做干细胞。
1.干细胞的概念：
2.干细胞的来源：
3.干细胞的类型：
在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
存在于 、 和 等多种组织和器官中。
早期胚胎
骨髓
脐带血
包括胚胎干细胞和成体干细胞等。
4．胚胎干细胞
（简称ES细胞）
①分布
②特点
③应用实例
④局限性
存在于早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
目前科学家已分离出了小鼠、兔、牛、猴和人等的ES细胞，在体外培养可分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等细胞。
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
5．成体干细胞
①分布
③特点
②常见类型
存在于成体组织或器官内的干细胞
造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
神经干细胞（神经系统中）
精原干细胞（睾丸中）
发现最早
研究最多
应用最成熟
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
④作用
有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。
⑤应用实例
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。
造血干细胞
神经干细胞
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
⑥面临的问题：
用于临床治疗存在导致肿瘤发生的风险
⑦应用展望：
6．诱导多能干细胞
（1）概念：
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞）。
（2）诱导方法：
①借助载体将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞均可）；
②用小分子化合物诱导形成。
（3）诱导多能干细胞优点：
①诱导过程无须破坏胚胎；
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
iPS细胞
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
（4）诱导多能干细胞的应用：
可治疗镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。
【问题探究6】三种干细胞的比较
比较 项目 胚胎干细胞 成体干细胞 诱导多能干细胞
来源 诱导高度分化的组织细胞形成
特点 具有分化成为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能 具有 ，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 类似胚胎干细胞；诱导无须破坏胚胎，应用前景更广泛
早期胚胎
成体组织或器官中
组织特异性
（1）干细胞都是来源于早期胚胎 （ 　　）
（2）iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，可以避免免疫排斥反应 （　 　）
（3）不同类型的干细胞，它们的分化潜能完全相同 （ 　　）
（4）干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用 （　　 ）
判断常考语句，澄清易混易错
【网络构建】
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是 ( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。 （ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 （ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清 （ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖 （ ）
练习与应用
一、概念检测
A
3．下列关于动物细胞培养所需要的条件的叙述，正确的是 (　 　)
A．为了创造无菌、无毒的环境，培养基中通常添加一定量的血清
B．动物细胞培养所需营养物质和植物组织培养的相同
C．动物细胞培养的适宜温度一般与动物的体温相近
D．动物细胞培养的适宜pH为酸性条件
4．干细胞是一种尚未充分分化的未成熟的细胞，医学家们正在尝试利用干细胞治疗一些顽疾。下列说法不正确的是 (　 　)
A．各种组织干细胞分化形成不同组织细胞是基因选择性表达的结果
B．利用干细胞治疗某些顽疾，是因为干细胞具有再生各种组织、器官的潜能
C．同一生物个体中，神经细胞与干细胞所含有的遗传物质不同
D．干细胞包括成体干细胞和胚胎干细胞
C
C
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
提示：像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
提示：该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
二、拓展应用

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