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(共69张PPT)
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
普通棉花
如何能培育出自身就能抵抗虫害 的棉花新品种呢？
转基因抗虫棉
第3章 基因工程
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花
基因工程
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
操作对象及环境
操作水平
操作原理
结果
生物体外
基因
DNA分子水平
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因重组
①【概念剖析】
优点？
能克服远缘杂交不亲和的障碍；
定向改造生物的遗传特性。
②基因工程理论基础的分析
【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
（1）DNA的基本组成单位都是 。
（2）双链DNA分子的空间结构都是 。
【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
（1） 是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）遗传信息的传递和表达都遵循 。
（3）生物界共用一套 。
四种脱氧核苷酸
规则的双螺旋结构
基因
中心法则
遗传密码
③基因工程的诞生和发展
1.1944年,艾弗里(O. Avery, 1877-1955)等人通过肺炎链球菌的转化实验,不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
2.1950年,埃德曼(P.V.Edman,1916-1977)发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后,桑格(F.Sanger，1918-2013)首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。
3. 1953年,沃森(J.D.Watson,1928一)和克里克(F.Crick,1916-2004)建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
4.1958年,梅塞尔森(M. Meselson, 1930-)和斯塔尔(F.W.Stahl,(M.1929——)用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。
5.1961年,尼伦伯格(M. W. Nirenberg,1927-2010)和马太(J. H. Matthaei,1929一)破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。
6.1967年,科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
7.1970年,科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶(简称限制酶)。
8.20世纪70年代初,多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
9.1972年,伯格(P.Berg,1926—)首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。
10.1973年,科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞,使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
11.1977年,桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
12. 1982年,第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
13.1983年,科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。
14.1984年,我国科学家朱作言(1941—)领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
15.1985年,穆里斯(K. Mullis, 1944—2019)等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。
16.1990年,人类基因组计划启动。2003年,该计划的测序任务顺利完成。
17.21世纪以来,科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。
18.2013年,华人科学家张锋(1982—)及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术——CRISPR(成类规律间隔短回文重复)技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
基于基因工程相关基础理论的突破和技术的创新，判断下列说法的正误。
（1）1953年，沃森和克里克建立了DNA分子双螺旋结构模型，并用实验证明了DNA分子的半保留复制。 （ ）
（2）1970年，在细菌体内发现了第一个限制酶，后来又发现了多种限制酶、DNA连接酶等。 （ ）
（3）1972年，伯格首先在体外进行DNA改造，并构建了第一个体外重组DNA分子。 （ ）
（4）1983年，科学家采用花粉管通道法培育了世界上第一例转基因烟草。 （ ）
（5）1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育了世界上第一条转基因鱼。 （ ）
（6）基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的。 （ ）
【从社会中来】
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
转基因番木瓜
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
培育转基因番木瓜
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
第1节 重组DNA技术的基本工具
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
目录 /CONTENTS
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制性内切核酸酶：切割DNA分子的工具，简称限制酶
1.来源：
2.种类：
3.作用：
主要从原核生物中分离纯化出来
迄今分离的限制酶有数千种
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
“两个特定”
A
T
G
C
腺嘌呤
胸腺嘧啶
胞嘧啶
鸟嘌呤
4种
脱氧核苷酸种类？
o
1’
2’
3’
4’
5’
脱氧
核糖
【回顾】DNA
DNA的基本单位？
脱氧（核糖）核苷酸
中文全称？
脱氧核糖核酸
一条脱氧核苷酸链
…
（3 ’、 5’）磷酸二酯键
5′
5′
3′
3′
A
P
脱氧
核糖
G
P
脱氧
核糖
T
P
脱氧
核糖
C
P
脱氧
核糖
脱氧
核糖
G
P
A
P
C
P
T
P
脱氧 核糖
脱氧 核糖
脱氧核糖
氢键
DNA的平面结构
一端有一个游离的磷酸基团
另一端有一个羟基（—OH）
①作用部位？
特定部位的磷酸二酯键
限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
②识别序列？
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；
EcoRⅠ
SamⅠ
TaqⅠ
5’…T-C-G-A…3’
3’…A-G-C-T…5’
也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
特点1：都可以找到一条中（心）轴线；
特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致
【资料卡】限制酶名字的由来--P72
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR 表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I 。
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到第3种限制酶，则分别命名为:
Hind III
4.切割结果
黏性末端
黏性末端
实例1—EcoR Ⅰ限制酶
形成黏性末端
识别特定序列为GAATTC
切割特定部位为G、A之间的磷酸二酯键
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
黏性末端？
…AATT
2024/3/4
实例2——Sma Ⅰ限制酶
平末端
形成平末端
识别特定序列为CCCGGG
切割特定部位为C、G之间的磷酸二酯键
当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。
【问题探究3】请写出下列限制酶切割形成的黏性末端。
黏性末端？
…GATC
…AATT
…AGCT
…GATC
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
【问题探究4】请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。
3
①
②
③
【问题探究5】请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：
（1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能
（2）请结合右图，推断限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水。
限制酶只能识别并切开双链DNA分子
两
2
2
两
【问题探究6】下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：
（1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用SmaⅠ 和PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（4）只用PstⅠ 酶切，最多能得到 种DNA片段。
2
3
5
5
【问题探究8】推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
【问题探究7】为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
第1节 重组DNA技术的基本工具
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
目录 /CONTENTS
1.DNA连接酶的种类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点
大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来；
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端；
恢复的都是磷酸二酯键
不能连接具有平末端的DNA片段。
又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）。
2.E·coli DNA连接酶的缝合作用
两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来
把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接两个双链DNA片段中的DNA单链缺口，但不能直接连接两条单链的DNA！
DNA连接酶作用部位？
是磷酸二酯键（扶手）
不是氢键
DNA连接酶将两个双链DNA片段“缝合”连接起来，形成一个双链DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。
T4 DNA连接酶的缝合作用
3.比较DNA连接酶和DNA聚合酶
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不 同 点 作用 实质 催化 加到已有脱氧核苷酸片段上，形成 . 催化两个 之间形成 .
作用 结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有 黏性末端或平末端的 连接起来，形成 .
模板 . .
相同点 ①化学本质都是蛋白质； ②都是催化形成 .
两个DNA片段
磷酸二酯键
不需要
互补
DNA片段
重组DNA分子
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
以DNA母链为模板，连接单个脱氧核苷酸形成单链
DNA聚合酶作用示意图
3.比较DNA连接酶和DNA聚合酶
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不 同 点 作用 实质 催化 加到已有脱氧核苷酸链片段上，形成 . 催化两个 之间形成 .
作用 结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有 黏性末端或平末端的 连接起来，形成 .
模板 . .
相同点 ①化学本质都是蛋白质； ②都是催化形成 .
单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
两个DNA片段
磷酸二酯键
磷酸二酯键
需要
不需要
互补
DNA片段
重组DNA分子
【问题探究8】请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别。
（1）若两个相同黏性末端都是由同种限制酶
（EcoRⅠ）切割后所得， （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图）。
能
（2）若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的识别序列
（填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图）。
不能
【核心归纳】与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用 部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用 对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA
作用 结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
DNA酶
（1）通过基因工程产生的变异是不定向的 （　 　）
（2）限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 （　 　）
（3）DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 （　 　）
（4）E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端 （　 　）
（5）限制酶和解旋酶的作用部位相同 （ 　　）
判断常考语句，澄清易混易错
第1节 重组DNA技术的基本工具
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
目录 /CONTENTS
将外源基因送入受体细胞，相当于一种运输工具，比喻为“分子运输车”
1.种类：
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
2.最常用的载体——质粒
是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
DNA分子复制的起点
特殊的标记基因
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
3.★载体作为载体所具备的条件及原因
①有一个至多个限制酶切割位点
供外源DNA片段（基因）插入其中
②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量
3.★载体作为载体所具备的条件及原因
③具有特殊的标记基因
如四环素抗性基因、
氨苄青霉素抗性基因等
便于重组DNA分子的筛选
④无毒害作用
避免受体细胞受到损伤
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的；这些质粒上常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
4. 质粒的作用
①作为运输工具，将外源基因导入受体细胞。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
【问题探究9】载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
【问题探究10】要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
【问题探究11】我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。
具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
（1）作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记
基因 （　 　）
（2）质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体 （　 　）
（3）载体（如质粒）和细胞膜中的载体蛋白的成分相同 （　 　）
（4）作为载体，必须要有标记基因 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
【核心探讨】标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
【探究 实践】DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
1.粗提取DNA的原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
①在酒精溶液中的溶解性：
②在NaCl溶液中的溶解性：
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
2.鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
二、材料用具
1.选材：
【思考】能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？
不能
哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 。
【思考】能否选用鸡血细胞做实验材料？
能
鸡是鸟类动物
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA
二苯胺试剂要现配现用，用棕色瓶保存。
《教材》P117——附录2
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
三、方法步骤
取材、研磨
过滤或离心取上清液
预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
1.取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的？
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
2．去除滤液中的杂质
方案一
方案二
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
低温放置几分钟的作用？
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。
3.DNA的析出
方案一
方案二
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
搅拌时应轻缓、并沿一个方向？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
4.DNA的鉴定
实验组
对照组
水浴加热
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。
混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
蓝色
材料的获取与研磨
去杂，析出DNA
DNA的鉴定
DNA鉴定的结果
方法步骤
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
四、结果分析与评价
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。
例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液（体积比为24：1），通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
进一步探究
五、操作提示
1．以血液（如鸡血细胞）为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
六、关键点拨
1．利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
2．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。
六、关键点拨
3．提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精提纯效果更佳。
预冷的酒精具有以下优点：
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
【网络构建】
练习与应用
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
练习与应用
二、拓展应用
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ
因为Xba I与Spe I切割产生了相同的黏性末端。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
3．基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是 （　 　）
A．能够复制，以便目的基因插入其中
B．具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选
D．对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选
C
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置（插入点有a、b、c）示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是 （ 　 　）
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b
A

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