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第1章 发酵工程
第3节 发酵工程及其应用
微
生
物
的
选
择
培
养和计数
微生物的选择培养
选择培养基
科学实例
筛选原因、思路、启示
选择培养基的原理、概念、类型、举例
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
稀释涂布平板法的操作过程
稀释涂布平板法的注意事项
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
培养基的制备
实验设计
分析与评价
微生物的数量测定
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
温故知新
从社会中来
青霉素
是世界上第一个应用于临床的抗生素。
早期科学家只能从青霉菌中提取少量青霉素，它的价格贵如金。
早期1瓶规格大概20万单位的青霉素最高卖到
一根金条
如今1瓶规格160万单位的青霉素注射剂
一元
那么，在工业上青霉素究竟是怎样生产的呢？
微生物纯培养技术的建立
密闭式发酵罐的设计成功
人们对发酵原理的认识
发酵工程形成
发酵工程的形成
发酵工程：是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。
发酵工程基本环节是什么？
在青霉素生产过程中如果有杂菌污染，某些杂菌会分泌青霉素酶，将青霉素分解掉。
生产柠檬酸
生产啤酒
生产青霉素
生产味精
黑曲霉
啤酒酵母
黄青霉
谷氨酸
棒状杆菌
在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。
接种
选育菌种
制备培养基
扩大培养
灭菌
发酵罐内发酵
分离、提纯产物
获得产品
性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
工业发酵罐的体积一般为几十到几百立方米，接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以，在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养
发酵工程中所用的菌种大多数是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
现代发酵工程使用的大型发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制；还可以进行反馈控制，使发酵全过程处于最佳状态。
电动机
排气管
pH计
冷却水排出口
冷却夹层
发酵液
搅拌叶轮
生物传感器装置
空气入口
放料管
阀门
培养物或营养物质的加入口
观察孔
取样管
温度传感器和控制装置
冷却水进入口
这是发酵工程的中心环节。在发酵过程中，要随时检测培养液中微生物的数量、产物的浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且会影响微生物代谢物的形成。
如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
一、发酵工程的基本环节
实例：谷氨酸的发酵生产：在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸；在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺
思考：扩大培养的目的是什么？怎样对菌种进行扩大培养？
增加菌种数量。将培养到生长速度最快时期的菌体分开，再进行培养。
思考：扩大培养所用的培养基，从性质上分类，是什么类型的培养基？
液体培养基。可以使微生物与营养物质充分接触，提高营养物质的利用率，有利于微生物的繁殖。
思考·讨论
思考：引起发酵罐内培养液的温度和pH变化的原因有哪些？
发酵工程中如何调节温度和pH
温度：原因：微生物分解有机物释放的能量，机械搅拌也会引起温度升高。
方法：常用冷却水进行温度的调节
pH：原因：培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累。
方法：是在培养基中添加缓冲液，在发酵过程中加酸或碱
电动机
排气管
⑦pH计
冷却水排出口
冷却夹层
发酵液
搅拌叶轮
⑧生物传感器装置
④空气入口
②放料管
③阀门
①培养物或营养物质的加入口
⑤观察孔
⑥取样管
⑨温度传感器和控制装置
⑩冷却水进入口
装置编号 主要用途
①②③ 控制培养物以一定速度进入、流出发酵罐，实现连续培养
④ 控制溶解氧
⑤⑥⑦⑧⑨ 通过肉眼观察、仪器检测等监控发酵条件以及发酵过程，⑥处抽取样品进一步检测
⑩ 通过控制冷水流速调节罐温
调节罐压
电机带动叶轮转动进行搅拌，使微生物与发酵液混合均匀，加快氧气溶解以及散热
发酵罐示意图
讨论1：微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用的菌种时需要考虑哪些因素？
①在低成本的培养基上能迅速生长繁殖；
②生产所需代谢物的产量高；
③发酵条件容易控制；
④菌种不易变异、退化等。
讨论2：怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？
要对温度、pH、溶解氧等发酵条件进行严格控制，使其最适合微生物的生长繁殖，同时及时添加必要的营养组分。
思考·讨论 发酵工程基本环节分析
讨论3： 在产物分离和提纯方面，发酵工程与传统发酵技术相比有哪些改进之处？
传统发酵技术获得的产物一般不是单一的组分，而是成分复杂的混合物，很多时候不会再对产物进行分离和提纯处理，或者仅采用简单的沉淀、过滤等方法来分离和提纯产物。
发酵工程中使用的分离和提纯产物的方法较多。发酵工程产物无论是代谢物还是菌体本身，都需要进行质量检査，合格后才能成为正式产品。
思考·讨论 发酵工程基本环节分析
讨论4：在进行发酵生产时，排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗？为什么？
不能。
因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染物的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废弃培养液进行二次清洁或灭菌处理。
思考·讨论 发酵工程基本环节分析
产物专一
生产条件温和
原料来源丰富且价格低廉
废弃物对环境污染小且容易处理
发酵工程的特点
在食品工业上的应用
在医药工业上的应用
在农牧业上的应用
在其他方面的应用
发酵工程的应用
二、发酵工程的应用
大豆中蛋白
小分子肽和氨基酸
酱油
黑曲霉
淋洗、调制
各种谷物、水果
酿酒酵母
各种酒类
（1）生产传统的发酵产品
1. 在食品工业上的应用
发芽
1
2
焙烤
3
碾磨
4
糖化
大麦
水
糖化罐
大麦种子发芽，
释放淀粉酶。
加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。
将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉。
淀粉水解
形成糖浆。
Ⅳ. 啤酒的工业化生产流程
②啤酒的工业化生产流程
（1）生产传统的发酵产品
蒸煮
5
6
发酵
7
消毒
8
终止
产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。
酵母菌将糖转化为酒精和CO2
杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期。
过滤、调节、分装啤酒进行出售。
糖浆
啤酒花
过滤
冷却
装瓶
装罐
储存罐
Ⅳ. 啤酒的工业化生产流程
（1）生产传统的发酵产品
②啤酒的工业化生产流程
①~⑥主发酵：完成酵母菌的繁殖，大部分糖的分解和代谢物的生成。
⑦~⑧后发酵：在低温、密闭的环境下储存一段时间,形成澄清、成熟的啤酒
讨论1：利用酵母菌进行酒精发酵过程中为什么要“先通气后密封”？
“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖；
“密封”的目的是使酵母菌进行酒精发酵产生酒精。
讨论2：啤酒生产中，发酵是重要环节，发酵后期，如果密封不严，会使啤酒变酸，你知道这是发生了什么变化吗？
醋酸菌是一种好氧菌，若发酵罐密封不严，酒精就会在醋酸菌的作用下被氧化产生乙醛，最后变为醋酸。
思考 · 讨论 啤酒的工业化生产流程（p24-25）
讨论3：与传统的手工发酵相比，在下面啤酒的发酵生产过程中，哪些工程手段使啤酒的产量和质量明显提高？
菌种的选育、对原材料的处理、发酵过程的控制，产品的消毒等，都有助于提高啤酒的产量和品质。
思考 · 讨论 啤酒的工业化生产流程（p24-25）
讨论4：现在市面上流行一种“精酿”啤酒，它的制作工艺与普通啤酒有所不同，如一般不添加食品添加剂、不进行过滤和消毒处理等。有人认为饮用“精酿”啤酒比饮用“工业”啤酒更健康，你怎么看待这个问题？“精酿”啤酒是小规模酿造产品，发酵时间长、产量低和价格高，却依然有着市场需求，我们如何辩证地看待大规模生产与小规模制作？
应该辩证地看待这一产品。一方面，这类产品具有多样化的特点，能够满足一些人对独特口感的需求，或者满足一些人的时尚追求。另一方面，这类产品是手工作坊式生产的，存在啤酒品质不稳定、价格昂贵的问题。
思考 · 讨论 啤酒的工业化生产流程（p24-25）
1. 在食品工业上的应用
（2）生产各种各样的食品添加剂
添加剂类型
酸度调节剂
增味剂
着色剂
增稠剂
防腐剂
添加了柠檬酸的饮料
增加食品的营养
改善食品的口味、色泽和品质
延长食品的保存期
食品添加剂的作用
（3）生产酶制剂
1. 在食品工业上的应用
食品直接生产
改进生产工艺
简化生产过程
提高产品产量
延长食品储存期
改善产品的品质和口味
酶制剂的作用
酶制剂
果胶酶
脂肪酶
α-淀粉酶
β-淀粉酶
氨基酸肽酶
2.在医药工业上的应用
（1）采用基因工程的方法，将植物或动物的基因转移到微生物中，获得具有某种药物生产能力的微生物。
②未来可能利用微生物生产过去只能从植物中分离提取的紫杉醇、青蒿素前体等化合物。
（2）直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。
①利用经过基因改造的微生物进行发酵生产生长激素释放抑制激素。
（3）利用基因工程，将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。例：一种生产乙型肝炎疫苗的方法就是将乙型肝炎病毒的抗原基因转入酵母菌，再通过发酵生产。
（1）生产微生物肥料
①微生物肥料的种类：根瘤菌肥、固氮菌肥
3. 在农牧业上的应用
②微生物肥料的作用：
Ⅰ. 生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长。
Ⅱ. 有的微生物肥料可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生。
（2）生产微生物农药
①微生物农药：利用微生物或其代谢物来防治病虫害。
②常见微生物农药：
微生物或代谢产物 防治病虫害种类
苏云金杆菌（Bt毒蛋白） 80多种农林害虫
白僵菌（真菌） 玉米螟、松毛虫
一种放线菌产生的抗生素（井冈霉素） 水稻枯纹病
微生物农药作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用
（3）生产微生物饲料
①原理：微生物含有丰富的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60%~80%，而且细菌生长繁殖速度很快。
②实例1——单细胞蛋白
Ⅰ. 单细胞蛋白生产过程：以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得了大量的微生物菌体，即单细胞蛋白。
Ⅱ. 单细胞蛋白成分：不仅含有丰富的蛋白质，还含有糖类、脂质和维生素等物质
Ⅲ. 单细胞蛋白应用：可以作为食品添加剂、微生物饲料等。其中微生物饲料能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。
（3）生产微生物饲料
③实例2-乳酸菌
在青贮饲料中添加乳酸菌，可以提高饲料的品质，使饲料保鲜，动物食用后还能提高免疫力。
（1）解决资源短缺和环境污染问题：利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质。
①极端微生物：自然界中还存在着一定数量的极端微生物，它们能在极端恶劣的环境（高温、高压、高盐和低温等环境）中正常生活。
②举例：嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂；嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。
4. 在其他方面的应用
（2）将极端微生物应用于生产实践
(1)生产柠檬酸需要筛选产酸量高的乳酸菌(　　)
(2)谷氨酸的发酵生产在酸性条件下容易形成谷氨酰胺和N－乙酰谷氨酰胺(　　)
(3)发酵工程生产条件温和、原料来源丰富，但废弃物对环境污染很大，不易处理(　　)
(4)单细胞蛋白指通过发酵而获得的微生物菌体(　　)
判断正误
×
√
×
√
与传统发酵技术相比,发酵工程的产品种类更加丰富,产量和质量明显提高。判断下列相关表述是否正确。
（1）发酵工程与传统发酵技术最大的区别就是前者可以利用微生物来进行发酵。（ ）
（2）发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身。（ ）
（3）在发酵工程的发酵环节中，发酵条件变化不仅会影响微生物的生长繁殖,也会影响微生物的代谢途径。（ ）
（4）通过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白。（ ）
×
√
√
×
练习与应用
一、概念检测
1. 在青霉素的发酵生产过程中，人们遇到了两个问题。请你运用所学知识或查阅资料，并发挥想象力，提出解决这些问题的思路。
（1）青霉素发酵是高耗氧过程，如何能够保证在发酵过程中给微生物持续高效地供氧呢 （提示：血红蛋白具有携带O2的能力）
可以用基因工程的方法，将血红蛋白基因转入青霉素生产菌来提高菌体对氧的吸收和利用率。
二、拓展应用
练习与应用
污水池中污泥样品
初选
振荡培养若干天后
测定各瓶中化合物A的含量
接种
候选菌
接种
选择
接种
接种
固体培养基
重复多次，直至获得目的菌。
1. 某化工厂为了处理排出污水中的一种有害的、难以降解的有机化合物A，其研究团队用化合物A、磷酸盐、镁盐和微量元素等配制了培养基，成功地筛选出能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如下图所示，请分析回答问题。
（1）在培养基中加人化合物A的目的是 ，这种培养基属于 培养基。
筛选出可以降解化合物A的微生物
选择
复习与提高
（2）培养若干天后,应选择培养瓶中化合物A含量 的培养液，接入新的培养液中连续培养，使目的菌的数量 。
较少
增加
（3）若要研究目的菌的生长规律，可挑取单个菌落进行液体培养，再采用 方法进行计数。请你预测目的菌的种群数量会发生怎样的变化。
细菌计数板计数
S形增长
污水池中污泥样品
初选
振荡培养若干天后
测定各瓶中化合物A的含量
接种
候选菌
接种
选择
接种
接种
固体培养基
重复多次，直至获得目的菌。
复习与提高
2.（2）下图所示为4种菌落分布图，一般不能由涂布平板法得到的是 。
A
B
C
D
B
复习与提高
本章结束！

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