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第2节 微生物的培养技术及应用
第1章 发酵工程
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点
通过连续划线将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基表面，经培养得到单菌落
接种环
涂布器
最后划线区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落;不能计数
①分离纯化菌种，获得单菌落②可用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的
两种纯培养方法的比较
问题1:怎么通过稀释涂布平板法统计活菌的数目呢？还有哪些统计活菌的方法呢？
（一）统计菌体数目：
1
2
显微镜直接计数法
稀释涂布平板计数法
血细胞/细菌计数板
——间接计数法
——直接计数法
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
微生物的数量测定
微生物的数量测定
课本P18
1.间接计数法 ——稀释涂布平板法
当样品的稀释度 时，培养基表面生长的一个 ，来源于 中的一个 。通过计数平板上的 数，就能推测出样品中大约含有多少 。
(1)原理：
足够高
菌落
样品稀释液
活菌
菌落
活菌
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目
稀释104倍
稀释105倍
稀释106倍
稀释107倍
微生物的数量测定
课本P18-19
1.间接计数法 ——稀释涂布平板法
(2)计数原则:
①通常选用_____________的样品液进行稀释，以保证获得菌落数为_______。
②选择菌落数为 的平板计数。
③ 稀释度下，应 对 个平板进行重复计数，然后求出 。
④统计的菌落往往比活菌的实际数目 。
⑤统计结果一般用 表示，而不是用活菌数表示。
30~300
同一
至少
3
平均值
少
菌落数
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键
因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
重复实验，保证结果的准确度
一定稀释范围
30~300
微生物的数量测定
课本P18
1.间接计数法 ——稀释涂布平板法
(3)计算公式:
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每克样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
每克样品中的菌落数＝
平板上平均菌落数
稀释液体积(ml)
×稀释倍数
微生物的数量测定
课本P18
1.间接计数法 ——稀释涂布平板法
每克样品中的菌落数＝
平板上平均菌落数
稀释液体积(ml)
×稀释倍数
实例分析1：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
2.请计算4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为 个。
1.1×108
微生物的数量测定
微生物的数量测定
课本P18
2.直接计数法 ——显微镜直接计数法
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
血细胞/细菌计数板
血细胞计数板：计数相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等。
细菌计数板：观察和计数细菌等较小的细胞。
优点：快速、直观
缺点：①不能区分死菌和活菌→统计值偏大
②不适于对运动细菌的计数
③个体小的细菌在显微镜下难以观察
问题2:为了避免上述缺点，我们该如何做？
可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）后再进行显微镜计数。
微生物的数量测定
2.直接计数法 ——显微镜直接计数法
血细胞计数板
方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。
中方格
小方格
（双线分割）
大方格
边长为1mm，深度为0.1mm
1个计数室的体积为0.1mm3。
1个计数室有400个小方格。
每个小方格的体积是1/4000mm3。
1mL培养液所含菌数＝每小格平均菌数×400×104×稀释倍数
微生物的数量测定
2.直接计数法 ——显微镜直接计数法
比较直接计数法与间接计数法
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数＝(C÷V )×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) M：稀释倍数 每毫升原液所含微生物数量：每小格平均微生物数量×400×10 000×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死菌和活菌
结果 比实际值_______ 比实际值________
偏小
偏大
1.提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？
每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。
2.做出假设
3.实验设计
实验步骤
土壤
取样
制备
培养基
样品稀释
与取样涂布
微生物的
培养与观察
实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
选择培养基的配方
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
提供无机盐
凝固剂
提供氮源
提供碳源
制备选择培养基
（尿素为唯一氮源）
制备牛肉膏蛋白胨培养基
思考：制备培养基时还要制备牛肉膏蛋白胨培养基，为什么？
对照作用
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
测放线菌：一般用103、104、105稀释液。
测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
B
A
C
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
③样品的稀释与涂布平板
1）每个浓度设置了 个平板，1、2、3平板是选择培养基（ 实验），
4为 培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；
2）另外，整个实验还要设置 个空白对照平板：未接种的 。
培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。
4
重复
牛肉膏蛋白胨
2
选择培养基和牛肉膏蛋白胨
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
④微生物的培养与观察
培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。
结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
因培养时间不足而导致菌落数目遗漏
24h
菌落数目稳定
注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等；
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
4.实验流程
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
稀释度 104 105 106
1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
每个平板的菌落数
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
4.实验流程
土壤取样
制培养基
样品稀释
涂布平板
观察培养
菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数。
稀释度 菌落形状 菌落大小 菌落颜色 平均值
104
105
106
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
五、结果分析与评价：
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 空白对照的培养基中无菌落生长
培养基中菌落数偏高
菌落形态多样，菌落数偏高
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目
样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板
重复组的结果
未被杂菌污染
被杂菌污染
混入其他氮源
选择培养基具有筛选作用
操作成功
若选取同一种土样，统计结果应相近
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
问题1:你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
问题2:得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
土壤中分解尿素细菌的分离与计数
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
方法：在培养基中加入酚红指示剂
——鉴别培养基
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。
思考
进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
补充
(1)原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。
红
(2)方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带(或变红)。
补充
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。
伊红和亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌
课本P30
刚果红培养基
鉴别纤维素分解菌
课本P20
将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。
测定饮水中大肠杆菌数量的方法：
滤膜法
到社会中去
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
结果分析评价
课堂小结
练习
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
(1)这种培养基是一种选择培养基。（ ）
(2)用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
(3)相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。( ）
√
√
√
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D

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