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工作任务10-1 邻二氮菲分光光度法测定水中微量铁
（一）目的要求
1．学会吸收曲线及标准曲线的绘制，掌握分光光度法的基本原理。
2．掌握用邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法。?
3．学会722S型分光光度计的正确使用。
（二）实验原理
根据朗伯 比耳定律：A=εcL，当入射光波长λ及光程L一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，即可以由标准曲线查得对应的浓度值，求组分的含量。
邻二氮菲是测定微量铁较好的显色剂。在pH为2～9溶液中，邻二氮菲与Fe2+生成稳定的橙红色配合物，显色反应如下
3C12H8N2 + Fe2+ = [Fe(C12H8N2)3]2+
此配合物lgK稳 =21.3，摩尔吸光系数ε510为1.1×104 L·mol 1·cm 1。在显色前，首先用盐酸羟胺将Fe3+还原成Fe2+。其反应如下
2Fe3+ + 2NH2 OH·HC1 = 2Fe2+ + N2↑ + 2H2O + 4H+ + 2C1
测定时若酸度高，反应进行较慢；酸度太低，则铁离子易水解。本实验采用HAc NaAc缓冲溶液控制溶液pH≈5.0，使显色反应进行完全。
（三）实验操作步骤
1．准备仪器及试剂
722S型分光光度计、酸度计、分析天平；容量瓶（棕色，50mL、100mL、500mL、1000mL）；吸量管（2mL、5mL、10mL），洗耳球。
硫酸铁铵、盐酸、盐酸羟胺、醋酸钠、醋酸、邻二氮菲，以上试剂均为分析纯。
2．溶液制备
（1）100 μg·mL 1铁标准溶液配制 准确称取0.8634g NH4Fe(SO4)2·12H2O，置于烧杯中，加入20mL 6mol·L 1 HCl溶液和少量蒸馏水，溶解后，定量转移至1000mL棕色容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得100μg·mL 1储备液。
（2）10μg·mL 1铁标准溶液配制 用移液管移取上述100μg·mL 1铁标准溶液10.00mL，置于100mL棕色容量瓶中，加入2.0mL 6mol·L 1HCl溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
（3）盐酸羟胺溶液（10%） 新鲜配制。
（4）邻二氮菲溶液（0.15%） 新鲜配制。
（5）HAc-NaAc缓冲溶液（pH≈5.0） 称取136g醋酸钠，加入60mL冰醋酸，加水使之溶解，加蒸馏水稀释至500mL。
（6）HCl 6mol·L 1
（7）待测水样 自来水
3．邻二氮菲-Fe2+吸收曲线的绘制
用吸量管移取铁标准溶液（10μg·mL 1）6.0mL，于50mL容量瓶中，加1mL 10%盐酸羟胺溶液、2mL 0.15%邻二氮菲溶液和5mL HAc-NaAc缓冲溶液，加蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，放置10min。选用1cm比色皿，以试剂空白（即在0.0mL铁标准溶液中加入相同试剂）为参比溶液，在波长440～540nm间，每隔10nm测量一次吸光度（在最大吸收波长处，每隔2nm或5nm）。以所测得吸光度A为纵坐标，以相应波长λ为横坐标，在坐标纸上（或计算机）绘制A与λ的吸收曲线，确定最大吸收波长λmax。
例如，不同吸收波长下铁标准显色溶液的吸光度，如表10-3。
表10-3 不同吸收波长下铁标准显色溶液的吸光度
波长(nm) 460 470 480 490 500 505 510 515 520 530 540
吸收度(A) 0.310 0.342 0.366 0.387 0.401 0.408 0.412 0.408 0.389 0.317 0.217
用计算机绘制邻二氮菲-Fe2+吸收曲线：
在Excel中，将波长和相应的吸光度分别输入第一列和第二列单元格，选定此数据区，点击“插入-散点图-带平滑曲线散点图”，可得两组数据散点图平滑曲线，如图10-8所示。
图10-8 绘制散点图平滑曲线
选中坐标轴，单击鼠标右键，设置坐标轴格式，如图10-9所示。再设计编辑图表布局，即得吸收曲线，如图10-10所示。
图10-9 设置坐标轴格式
图10-10 编辑得到的邻二氮菲-Fe2+吸收曲线
从吸收曲线可得，邻二氮菲-Fe2+配合物最大吸收波长λmax=510 nm。
4．标准曲线（工作曲线）的绘制
用吸量管分别移取铁标准溶液（10μg·mL 1）0.0、2.0、4.0、6.0、8.0，10.0mL分别置于6个50mL容量瓶中，分别依次加1mL10%盐酸羟胺溶液，稍摇动，加2.0mL0.15%邻二氮菲溶液及5mL HAc NaAc缓冲溶液，加蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，放置10min。用1cm比色皿，以试剂空白（即在0.0mL铁标准溶液中加入相同试剂）为参比溶液，选择λmax为测定波长，测量各溶液的吸光度，如图10-11所示。
图10-11 铁标准系列溶液的制备和吸光度测定
按照第五章标准曲线的计算机绘制方法，以含铁量c为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。如图10-12是编辑得到的标准曲线及其线性回归方程（示例）。
图10-12 编辑得到的标准曲线及其线性回归方程
5．试样中铁含量的测定
取含铁水样25mL，共取3份，分别置于3个50mL容量瓶中，按上述方法显色，并测其吸光度，如图10-13所示。此步操作和条件应与系列标准溶液显色、测定完全相同，并且同时进行。
图10-13 试样中铁试液制备和吸光度测定
依据水样A值，从标准曲线上即可查或计算得其浓度，再乘于试样稀释倍数，计算出水样中含铁量(以μg·mL 1表示)，取平均值，计算相对平均偏差。
（四）722S型可见分光光度计的使用
1.仪器功能部位示意图
722S型可见分光光度计各功能部位，如图10-14所示。
1. 液晶显示屏 2. 0%T调节按钮，数字下调按钮 3.100%T调节按钮，数字上调按钮 4.模式转换按钮
5.功能按钮 6.模式显示 7.波长调节按钮 8.波长指示窗 9.试样槽 10.试样移动拉杆
图10-14 722S型可见分光光度计
2．操作方法
（1）打开仪器总开关，开机预热30分钟，可进行测量工作。
（2）选择波长：使用波长调节按钮，即可方便地调整仪器当前测试波长，具体波长由旋钮左侧的显示窗显示，读出波长时目光垂直观察。
（3）调0%T：打开试样盖（关闭光门）或用不透光材料在试样室中遮断光路，然后按0%键，即能自动调整零位。
（4）调100%T：将参比溶液置入试样室光路中，盖下试样槽盖，按100%键，即能自动调整100%T（一次有误差时可再按一次）。
（5）改变试样槽位置让不同试样进入光路。打开试样室，试样位置最靠近测试者的为“0”，依次为“1”、“2”、“3”位置，对应拉杆推向最内为“0”位置，依次为“1”、“2”、“3”位置，当拉杆到位时有定位感，到位时轻轻推动一下确保定位正确。
（6）确定滤光片位置
本仪器备有减少杂光，提高340～380nm波段光度准确性的滤光片，位于试样室内部左侧，用一拨杆来改变位置。当测试波长在340～380nm波段内如作高精度测试可将拨杆推向前（见机内印字指示）。通常可不使用此滤光片，可将拨杆置于400～1000nm位置。
（7）改变标尺
仪器设有四种标尺：
透射比：用于对透明液体和透明固体测量透射特点。
吸光度：用于采用标准曲线法或其他方法定量分析，在作动力学测试时亦能利用本系统。
浓度因子：用于在浓度因子法浓度直读时设定浓度因子。
浓度直读：用于标样法浓度直读时，作设定和读出，亦用于设定浓度因子后浓度直读。
各标尺间转换用“模式”键操作，并由“透射比”，“吸光度”，“浓度因子”，“浓度直读”指示灯分别指示，开机初始状态为“透射比”，每按一次顺序循环。
（8）测定透明溶液的吸光度：预热→设定波长→置入参比溶液→调0%T、100%T（重复3次以上）→置标尺为“吸光度”→试样置入光路→读出数据。
3．注意事项
（1）测定过程中，不要将参比溶液拿出试样室，应将其随时推入光路以检查0%T、100%T是否变化。注意每次改变波长或灵敏度时，都要用参比溶液调0%T和100%T。
（2）为了避免光电管长时间受光照射引起的疲劳现象，应尽可能减少光电管受光照射的时间，不测定时应打开暗室盖，特别应避免光电管受强光照射。
（3）吸收池盛取溶液时只需装至吸收池的4/5即可。手指拿吸收池时只能与磨砂面接触。若溶液溢在外面应先用吸水纸吸干水分，再用镜头纸擦干净。
（4）若大幅度调整波长，应稍等一段时间再测定，让光电管有一定的适应时间。
（5）每台仪器所配套的吸收池，不能与其他仪器上的吸收池单个调换。

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