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(共29张PPT)
1.1.2 微生物的选择培养与计数
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
（一）选择培养基
美国黄石国家公园的一个热泉
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
二、微生物的选择培养
1.稀释涂布平板法
①铲取土壤，将样品装入纸袋中
②将10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的是试管中，依次等比稀释
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
（1) 将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按102～107的顺序编号。
（2) 用移液管吸取1mL锥形瓶中稀释10倍的菌液，注入102倍稀释的试管中。用手指轻压移液管的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。
（3) 从102倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入103倍稀释的试管中，重复第（2) 步的混匀操作。依次类推，直至完成最后一支试管的操作。
梯度稀释操作
拓展
（1) 各操作细节要保证“无菌”。例如，移液管要经过灭菌。梯度稀释时，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。
（2) 将涂布器浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
（3) 操作中要注意防火。涂布结束后，应将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。
稀释涂布平板法操作的几点注意事项：
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作 接种环在固体平板培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高，为确保试验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板
提出问题
（1）如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
实验过程
（1）土壤取样
①取样地点要求：
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在
使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手。
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源。
组分 含量
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
提供无机盐；
调节pH。
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（3）样品的稀释与涂布平板
测细菌时，一般选用1×104、1×105、×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
微生物的培养和观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果
原因：防止因培养时间不足导致遗漏菌落数目
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
1 2 3 4 5 6 7 8 时间/天
数量
45
40
35
30
操作提示
1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
2.要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
两组的土壤不同；某一组被杂菌污染等；
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —显微镜直接计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计

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