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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
第2课时 微生物的选择培养和计数
自然界中微生物数量繁多，想要分离出特定的微生物，仅仅是通过平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
同理：
人为提供有利于目的菌生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的条件，进行实验室微生物的筛选。
选择培养基
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
耐寒微生物
石油分解菌
被石油污染的土壤
冰川冻土层
一、选择培养基
1.实验室中微生物筛选的原理：
人为提供 的条件（包括 、 和 等），同时 。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
2.概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
3.类型：
在培养基中加入某种化学物质
改变培养基中的营养成分
改变微生物的培养条件
3.类型:
（1）改变培养条件。
70～80℃的高温
分离耐高温的水生栖热菌
使用将pH调至酸性的培养基
分离耐酸菌
（2）改变培养基中的营养成分。
不加碳源（含碳有机物）的培养基
不加氮源的培养基
分离出固氮微生物
分离出自养型微生物
（3）添加某种化学物质。
加入青霉素
分离酵母菌、霉菌等真菌（青霉素能杀死细菌、放线菌）
加入高浓度食盐的培养基
分离得到金黄色葡萄球菌
石油是唯一碳源
分离出分解石油微生物
嗜油菌
金黄色葡萄球菌
尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。
土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶：
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
思考·讨论 选择培养基配方的设计
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
进一步思考
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
基础培养基
选择培养基
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基一
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4 ·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是_______________；该类培养基的主要用途为_______________。
2.从用途上来讲， 属于选择培养基，目的是为了获得 。
3.两种培养基共有的培养基成分有：
。
培养基一的碳源为 ，氮源为 ；
培养基二的碳源为 ，氮源为 。
固体
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数、保存
培养基二
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
【现学现用】
二、微生物的选择培养
方法:
稀释涂布平板法
主要过程:
梯度稀释菌液和涂布平板
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到制备好的选择培养基上，进行培养。
稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
土壤细菌的数量庞大，怎么获得想要得到的特定微生物的纯培养物呢？
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。
操作步骤:
（1）土壤取样
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
注意
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
1×102
9mL无菌水
将10 g土样加到盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
（2）样品的稀释（梯度稀释菌液）
90 mL的无菌水
10g土样
①取0.1mL 菌液滴加到培养基表面
1×107
移液枪
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
（3）涂布平板
微量
移液器
（4） 微生物培养
①待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置（同时放一个未接种的培养基），放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。
恒温培养箱
②在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
（1）培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1~2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
结果评价:
（2）接种操作是否符合无菌要求
如果培养基上生长的菌落的颜色、性状、大小基本一致，并符合目的菌的菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；
如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
注意事项：
注意事项三
注意事项四
注意事项一
注意事项二
将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行
10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；
由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面___________操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。（不能计数） 将菌液进行一系列的 ，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。（可计数）
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂
平板 示图
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得 ， 达到分离微生物的目的，也可以观察菌落特征。 连续划线
梯度稀释
归纳总结：平板划线法与稀释涂布平板法的比较
单菌落
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
1.稀释涂布平板法
2.显微镜直接计数法
——间接计数法
——直接计数法
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
选择30-300个菌落的平板进行计数；
每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
统计的菌落往往比活菌的实际数目低；
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示；
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
计数原则:
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
三、微生物的数量测定
计算公式：
每g样品中的菌落数 = （ C ÷ V ） × M
C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）
M：稀释倍数
【例】某同学在均使用0.1mL菌液，稀释倍数为105的培养基中测得3个平板上菌落数为80、90、100，那么每g样品中菌落数是（ ）
A. 900 B. 9.0×107 C. 90 D. 9.0×106
B
三、微生物的数量测定
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
2.直接计数法 — 显微镜直接计数法
利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
缺点：
a.不能区分死菌和活菌→偏大。
b.不适于对运动细菌的计数。
c.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
优点：
快速、直观
血细胞计数板：
细菌计数板：
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。
中方格
小方格
血细胞计数板
（双线分割）
大方格
边长为1mm，深度为0.1mm
1个计数室的体积为0.1mm3。
1个计数室有400个小方格。
每个小方格的体积是1/4000mm3。
1mL培养液所含菌数＝每小格平均菌数×400×104×稀释倍数
2. 显微镜直接计数（总菌数计数）
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
一
提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
二
作出假设
三
实验原理
利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
探究.实验
三、微生物的数量测定
（1）土壤取样
（2）配制培养基
（3）样品的稀释与涂布平板
（4）微生物的培养与观察
取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤
取样过程：铲去表土（一般3cm左右）
注意事项：铁铲和取样袋在使用前都要灭菌；事毕洗手。
选择培养基*以尿素为唯一氮源
完全培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）——作为对照，来判断选择培养基是否具有选择作用
1.操作步骤：
①每个浓度至少设置4个平板
选择培养基（平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
②本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。
例：标记注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
（3）样品的稀释与涂布平板
培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目）
一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
不一定，还需要进一步的鉴定
（4）微生物的培养与观察
2.结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂菌污染 的判断 未接种的培养基上没有菌落生长
未接种的培养基上有菌落生长
选择培养基的 筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的数目
样品的稀释 操作 得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
重复组的结果 未被杂菌污染
被杂菌污染
选择培养基具有筛选作用
操作成功
若选取同一种土样，统计结果应相近
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
原理：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。
鉴定培养基
方法：
呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
结果分析评价
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。 （ ）
练习与应用（P20）
√
√
√
一、概念检测
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是恒定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
练习与应用（P20）
一、概念检测

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