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(共20张PPT)
第1章 发酵工程
1.2.2 微生物的选择培养和计数
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
1.制备培养基
3.培养酵母菌
①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）
②灭菌
③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）
培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）
培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）
用接种环在固体培养基上用平板划线法接种
平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养
问题1：自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？
温故知新：酵母菌的纯培养
选择培养基应运而生
从社会中来
课本P16
科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌(Taq酶)，并分离到耐高温的DNA聚合酶。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
美国黄石公园
1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找
启示：根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。耐寒微生物耐热微生物石油分解菌问题2：这对在实验室中选择培养特定的微生物有什么启示？如何筛选？什么是选择培养基？
选择培养基
课本P16
1.实验室中微生物筛选的原理：
人为提供 的条件（包括 、_____
和 等），同时 。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
2.选择培养基的概念：
在微生物学中，将允许 生长，同时_____
或 其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
特定种类的微生物
抑制
阻止
选择培养基
培养基中加A毒素
具有A毒素抗性的菌落
培养基原有菌落
没有A毒素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗A毒素能力的细菌
没有A毒素抗性的细菌
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
（1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长
原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用
配制：使用____________的培养基
（2）目的：分离固氮菌
原理：固氮微生物能利用空气中的氮气
配制：使用_______________________的培养基
（3）目的：分离自养型微生物
原理：自养型微生物能利用无机碳源
配制：使用___________________________的培养基
（4）目的：分离耐酸菌
原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长
配制：使用_______________的培养基
加入青霉素
不加氮源（以N2为氮源）
不加有机碳源（以CO2为碳源）
将pH调至酸性
应用
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
选择培养基
2.概念:
3.类型:
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
类型 条件 分离得到的菌种
改变培养条件 70～80℃的高温
添加某种化学物质 加入青霉素
高浓度食盐
特殊碳、氮源 石油是唯一碳源
营养缺陷 不加碳源
不加氮源
水生栖热菌
酵母菌、霉菌等真菌
金黄色葡萄球菌
能消除石油污染的微生物
自养型微生物
固氮菌
选择培养基
尿素[CO（NH2）2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。
CO（NH2）2
+ H2O
CO2
+ 2NH3
NO3-
NH4+
脲酶
转化
尿素
问题3：如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
选择培养基配方的设计
选择培养基配方的设计
(1)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
(2)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可催化尿素分解产生NH3，NH3可作为微生物生长的氮源。
培养基:培养可以分解尿素的细菌
思考
分析如何判断选择培养基是否有杂菌污染以及选择培养基是否能筛选出一些菌落(即选择培养基是否具有选择性)？
①如果没有接种的选择培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。
②如果接种后的完全培养基(或基本培养基→牛肉膏蛋白胨)上的菌落数明显多于接种后的选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些菌落。
问题4：仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
（一）方法：
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
计数：测定分解尿素的细菌的数量
稀释涂布平板法
是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
1.概念：
二、微生物的选择培养
（一）方法：
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法（统计菌落数）
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
关键
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键
二、微生物的选择培养
（一）方法：
稀释涂布平板法
3.实验设计：
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3~8cm的土壤层。取样时，一般要铲去表层土。
取样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌，操作完整后，一定要洗手。
公园里、街道旁、花盆中
城市：
农田里、菜园里
农村：
（1）土壤取样：
二、微生物的选择培养
3.实验设计：
（2）样品的稀释与涂布：
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
10g
9 mL 无菌水
90mL无菌水
二、微生物的选择培养
在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
2.稀释涂布平板法及其操作过程：
微量
移液器
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养
注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。
二、微生物的选择培养
3.培养与观察：
待涂布的菌液被 后，将接种和未接种平板 ，放入 中培养 d，在涂布有 菌液的平板上就可以观察到分离的 。
培养基吸收
倒置
恒温培养箱
恒温培养箱
1~2
合适浓度
单菌落
稀释104倍
稀释105倍
稀释106倍
空白对照
培养未接种的培养基的作用是对照，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
二、微生物的选择培养
3.实验设计：
（3）微生物的培养：
问题5：与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
平板划线法
稀释涂布平板法
二、微生物的选择培养
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
用途
接种效果图
相同点 通过连续划线将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基表面，经培养得到单菌落
接种环
涂布器
最后划线区域挑取
稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
分离纯化菌种，获得单菌落;不能计数
①分离纯化菌种，获得单菌落②可用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的
两种纯培养方法的比较
4.注意事项：
注意事项三
注意事项四
注意事项一
注意事项二
将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行
10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；
由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证
（一）方法：
稀释涂布平板法
二、微生物的选择培养

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