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第二节 动物细胞工程
一 动物细胞的培养
1.动物细胞培养需要哪些基本条件？
2.动物细胞培养的基本操作过程是什么？
3.怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
动物细胞工程
动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
1.动物细胞培养的条件
2.动物细胞培养的过程
3.干细胞培养及应用
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
原理：细胞增殖（有丝分裂）
动物细胞培养的条件
一般来说，动物细胞培养（模拟体内细胞正常生长增殖的环境）需要满足以下条件：
动物细胞培养所需的基本条件
营养
条件
其他
条件
①糖类、
②氨基酸、
③无机盐、
④维生素……
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
充足的营养、稳定的内环境
动物细胞培养的条件
1.营养条件:
(1)合成培养基:将细胞所需的营养物质按_____________严格配制而成。
(2)天然成分:_____等。
(3)一般使用_____培养基,即培养液。
种类和所需量
血清
液体
营养物质主要包括：糖类、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、微量元素等。
血清中含有多种维持细胞代谢和生长的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促细胞生长因子等。
合成培养基 + 血清等天然成分
动物细胞培养的条件
2.无菌、无毒的环境:
(1)培养液和培养用具_____处理。
(2)_____环境下操作。
(3)培养液定期更换的原因:_______________________________________________
3.温度、pH和渗透压:
(1)适宜的温度:哺乳动物多以__________ ℃为宜。
(2)适宜的pH:多数细胞生存的适宜pH为_________。
(3)适宜的渗透压。
4.气体环境:95%空气和5%CO2的CO2培养箱中。
(1)O2作用:_________________。
(2)CO2的主要作用:_______________。
36.5±0.5
7.2～7.4
细胞代谢所必需的
维持培养液的pH
清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
无菌
灭菌
无菌处理；定期更换培养液；添加抗生素等
CO2培养箱
动物细胞培养的过程
请同学们自主阅读教材P44-45，小组合作思考讨论完成问题。
1.请构建动物细胞培养过程流程图。
2.为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？
3.为什么将取出的组织分散成单个细胞？如何将组织分散成单个细胞？说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶可以吗？
4.在用胰蛋白酶处理组织时应注意什么？
5. 什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？
6.为什么要进行分瓶培养？怎么处理？
7.什么是原代培养和传代培养？两种“培养”都用到胰蛋白酶处理，对象相同吗？
动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
加培养液
在培养皿或培养瓶内
1.取动物组织：
部位
原因
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
分化程度低，增殖能力强
2.分散成单个细胞：
原因
①成块组织中细胞与细胞靠在一 起，彼此限制了生长与增殖；
②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。
动物细胞培养的过程
原代培养
通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
传代培养
将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
动物细胞培养的过程
第1类：悬浮生长细胞
动物细胞培养的类型：
第2类：贴壁生长细胞
（主流）
接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。
悬浮培养瓶
细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。
动物细胞培养的过程
由于细胞之间有接触抑制的特性，一般的正常细胞并不重叠于其他细胞之上生长，而是单层生长。
癌细胞由于无接触抑制而能够继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，发生堆积。
是否接触抑制可作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。
动物细胞培养的过程
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
动物细胞培养的过程
动物细胞培养
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
相同点 获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
我们可否运用动物细胞培养技术在体外培养干细胞使之成为组织或器官吗？
动物细胞培养
干细胞培养及其应用
电镜下的胚胎干细胞（照片经后期人工上色处理，放大约1500倍）
干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫作干细胞。
干细胞存在于___________、_________和__________等多种组织和器官中
早期胚胎
骨髓
脐带血
干细胞类型_____________________________________
胚胎干细胞（ ES细胞）和成体干细胞
干细胞培养及其应用
（1）胚胎干细胞（ ES细胞）
①分布：
②特点：
③成功案例：
早期胚胎
具有分化成为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞
（2）成体干细胞
①分布：
②特点：
③发现最早、研究最多、应用最为成熟的一类成体干细胞是：
成体组织或器官内
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的潜能。
造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血
干细胞培养及其应用
类型 应用 优点
造血干细胞
神经干细胞 诱导多能干细胞 （iPS细胞） 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如白血病、帕金森病、阿尔茨海默病等）
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应
体外诱导小鼠成纤维细胞
诱导多能干细胞
iPS细胞
临床治疗人类疾病
多种体细胞
定向诱导分化
如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
干细胞培养及其应用
思考1：制备iPS细胞的其它方法有哪些？
①借助载体将特定基因导入细胞中；
②直接将特定蛋白导入受体细胞中；
③用小分子化合物来诱导形成iPS细胞。
思考2：干细胞用于临床治疗面临的问题有什么？
如存在导致肿瘤发生的风险
干细胞培养及其应用

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