资源简介

(共50张PPT)
第2节 动物细胞工程
二、动物细胞融合与单克隆抗体的制备
能否让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢
融合细胞
细胞
融合
37℃
40min
正在融合的细胞
红色荧光染料标记膜蛋白
绿色荧光染料标记膜蛋白
人细胞
小鼠细胞
灭活的病毒诱导细胞融合的
1.概念
使_____或_____动物细胞结合形成_____细胞的技术
2.结果
形成的 具有_________________________
3.原理
____________________
两个
多个
一个
杂交细胞
原来两个或多个细胞的遗传信息
细胞膜具有一定的流动性
一 动物细胞融合技术概述
4.诱导融合的常用方法
PEG融合法
电融合法
灭活病毒诱导法
用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
（1）.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？
（2）.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
5.融合实质及完成的标志：
细胞核的融合
6.意义
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
7.应用
①细胞融合技术已经成为研究 、 、 和 等的重要手段
②利用动物细胞融合技术发展起来的 ，为_____ 开辟了新途径
细胞遗传
细胞免疫
肿瘤
培育生物新品种
杂交瘤技术
制造单克隆抗体
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞膜具有一定的流动性；植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
机械的方法
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使组织分散成单个细胞
物理：电融合法、离心法；
化学：PEG融合法、高Ca2+-高pH融合法
物理：电融合法
化学：PEG融合法
灭活病毒诱导法
二 动物细胞融合和植物体细胞杂交比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
二 动物细胞融合和植物体细胞杂交比较
（1）与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒 （　 　）
（2）灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构 （　　 ）
（3）二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
二、单克隆抗体的制备
1.机体通过什么免疫过程分泌抗体？
2.抗体由什么细胞产生？
3.抗体的化学本质是什么？
4.与抗原作用的特点？
5.抗体主要分布在哪里？
主要分布在血清中。其次在组织液及外分泌液中也含有。
抗体是机体受抗原刺激后B淋巴细胞增殖分化形成的浆细胞产生
具有免疫功能的球蛋白
能与该抗原发生特异性结合
回顾旧知
抗体
体液免疫
三、单克隆抗体的制备
抗体:机体产生的专门应对抗原的蛋白质
每种浆细胞只能产生一种抗体
1.传统抗体的获得
向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。
产量低、纯度低、特异性差
(2)缺点：
二
(1)方法:
可产抗体，但不能无限增殖
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
抗原不纯
抗体不纯
三、单克隆抗体的制备
大量制备单一抗体的思路和需解决的问题
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
单一B淋巴细胞
细胞群
选择
克隆
产生
大量纯度高特异性强的抗体
不可能无限增殖
哪种细胞可以无限增殖？
三、单克隆抗体的制备
肿瘤细胞
产生抗体的B淋巴细胞
3.单克隆抗体制备思路
一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）
能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
大量的特定抗体
米尔斯坦
科勒
发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
三、单克隆抗体的制备
1.B淋巴细胞的特点（优点和局限性）*？
2.癌细胞的特点（优点和局限性）*？
3.杂交瘤细胞的特点？
能产生单一的特异性抗体，但不能无限增殖
能在体外大量增殖，但不能产生抗体
既能大量增殖，又能产生抗体
三、单克隆抗体的制备
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
4. 过程：
特定抗原免疫小鼠，从脾中获取产生特定抗体的B淋巴细胞
1.注射特定抗原的目的是？
2.这里的多种B淋巴细胞一般可以分为哪些类型？
①产生其他抗体的B淋巴细胞
②产生针对注射抗原的抗体的B淋巴细胞
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
4. 过程：
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
只考虑两两融合，诱导融合之后，
一定会得到杂交瘤细胞吗？
杂交细胞
BB B瘤 瘤瘤
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
( 既能迅速大量增殖，又能产生抗体 )
筛选
BB B瘤 瘤瘤
4.如何筛选到杂交瘤细胞（B瘤细胞）？
方法：
特定的选择培养基
杂交瘤细胞才能生长。
原理：
未融合的亲本细胞
融合的具有同种核的细胞
死亡
资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞（A）
合成DNA
D途径
S途径
D途径
氨基喋呤
A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3
5.得到的杂交瘤细胞一定是所需的吗？
不一定
杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（产其他抗体的B淋巴细胞，产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选；
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳
性的杂交瘤细胞
第一次
筛选
第二次
筛选
第二次筛选的目的：
获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
具体做法：
克隆化培养
抗体检测
经多次筛选
第二次筛选：
克隆化培养、抗体检测？
多孔细胞培养板
96孔板
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
①将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。
②然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
③阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
检测原理？
抗原—抗体能够特异性结合
克隆化培养和抗体检测
★
有限稀释法
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
抗原和抗体能够特异性结合
抗体检测的原理是什么？
(分子水平的鉴定）
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳
性的杂交瘤细胞
小鼠腹腔
注射
体外培养
单克隆抗体
从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体
第一次
筛选
第二次
筛选
7.杂交瘤细胞的大规模培养，进而大量获得单克隆抗体？
培养杂交瘤细胞的方法比较
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因
筛选 目的 筛选出？ 筛选出 的杂交瘤细胞
筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
能分泌所需抗体
死亡
抗体检测
生长
诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
应用到的技术？
原理？
细胞膜的流动性
多种杂交细胞及未融合的细胞
诱导 融合
小鼠骨髓瘤细胞
多种B淋巴细胞
给小鼠注射特定抗原
提取
杂交瘤细胞
第一次筛选
用特定的选择性培养基
第二次筛选
足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞
体外培养
注射到小鼠腹腔
大量单克隆抗体
克隆化培养、抗体检测
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
（能产生抗体）
（能无限增殖）
从腹腔液中提取
从培养液中提取
（进行多次）
动物细胞融合
动物细胞培养
细胞增殖
单克隆抗体制备过程
1.如何筛选到杂交瘤细胞？
利用选择培养基进行筛选
2.如何筛选到所需的杂交瘤细胞？抗体检测的原理是什么？
对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测
原理:抗体与抗原的结合具有特异性
3.获得单克隆抗体的场所是哪里？
若在培养液中进行杂交瘤细胞培养，则从细胞培养液中提取，若在小鼠或其他动物腹腔中培养，则从腹水中提取。
单克隆抗体的应用
用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以做出诊断，这比原来的诊断提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
资料1
四 单克隆抗体的应用
单克隆抗体的应用
人绒毛膜促性腺激素
资料1
随尿液排出
抗人绒毛膜促性腺激素的单克隆抗体试剂盒
阳性
抗（人绒毛膜促性腺激素）单克隆抗体
在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。
思考:正常的性成熟女性每个月都会排卵，最佳受精时间为排卵后24-36小时。在女性的月经周期中，尿液中的促黄体生成素（SH）会在排卵前24小时左右出现高峰值。据此可推测，排卵试纸起核心作用的物质是_____________________________。
抗促黄体生成素单克隆抗体
使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。
抗体-药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成。
资料2
抗原
肿瘤细胞
讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
讨论2：除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作
为ADC偶联的药物？
②可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
③一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
讨论3：单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；
生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点
★单克隆抗体的优点
（1）能准确地识别抗原的细微差异；
（2）与特定抗原发生特异性结合；
（3）可以大量制备。
单克隆抗体的应用
（1）广泛用作诊断试剂
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
（2）运载药物：
如抗体-药物偶联物（ADC）。
生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤
(单抗导向，药物为弹头)
优点：位置准确、疗效高、副作用小
（3）直接用于治疗疾病。
实例：利妥昔单抗(美罗华)是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
在医学领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。
应用①：作为诊断试剂 (最广泛的用途)
应用②：运载药物
应用③：治疗疾病
四 单克隆抗体的应用
（1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞（　 　）
（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同（ 　　）
（3）ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用（　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
单克隆抗体制备过程中的相关考点总结
（1）该过程中应用到的技术_______________________________________
（2）原理_______________________________________
（3）注射特定抗原的目的______________________________________________
（4）诱导融合的方法______________________________________
动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
灭活病毒诱导法
（5）第一次筛选的目的______________________
第一次如何筛选___________________________
筛选原理____________________________________________________
_____________________________
筛选获得杂交瘤细胞
用特定的选择培养基进行筛选
在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________
（7）第二次筛选的目的________________________________________________
如何筛选_______________________________________ ____________
选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________ _____________
（8）抗体检测原理_______________________________________
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
分泌的抗体能与特定的抗原结合
抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）
既能迅速大量增殖，又能产生抗体
（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________
（10）如何获取单克隆抗体
①体外培养___________________________
②小鼠腹腔内培养_________________________
（11）单克隆抗体的优点_____________________________
_________________________________________________
在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖
从细胞培养液中获取
从小鼠腹水中获取
能准确地识别抗原的细微差异，
与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备
阳
单克隆抗体制备过程中的相关考点总结
练习与应用
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
C
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为
杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离
出的抗体为单克隆抗体
A
3．如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是 （ ）
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的细胞毒性T细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞
D
4、抗PD-L1单克隆抗体能与癌细胞膜表面的PD-L1特异性结合，因而具有治疗某些癌症的作用。如下图是制备抗PD-L1单克隆抗体的示意图，下列叙述错误的是（ ）
A．提取的脾B淋巴细胞有多种，是因为一种病原体可以诱导产生多种B淋巴细胞
B．多孔玻璃板中的细胞为B淋巴细胞和鼠瘤细胞的融合细胞
C．图中细胞集落a-d既能大量繁殖，又能产生抗体
D．图中细胞集落a可用于扩大化培养生产抗PD-L1单克隆抗体
B
5．抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列表述正确的是 （ ）
A．ADC可通过主动运输进入肿瘤细胞
B．抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡
C．单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合
D．肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，所以不会产生新的蛋白质
C

展开更多......

收起↑