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第三章 基因工程
第一节 重组DNA技术的基本工具
基因工程是指按照人们的愿望，并通过体外___________等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做__________技术。
转基因
DNA重组
1.基因工程的概念
对基因工程概念的理解
基因工程的别名：
操作环境：
操作对象：
操作水平：
原 理：
结 果：
重组DNA技术、转基因技术
生物体外
基因
分子水平
基因重组
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
定向改造生物性状，彻底打破了生殖隔离
特点：
转基因技术生产胰岛素
基因工程实例
转基因木瓜
转基因抗虫棉
辣椒香蕉
培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜
抗番木瓜环斑病毒基因提取
抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接
抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术的基本工具
2.基因工程的过程
首先要在______对含有_________的DNA分子进行_______、改造和________，然后将________________导入受体细胞体内，并使其在细胞中表达
体外
切割
重组DNA分子
拼接
所需基因
基因工程的过程：
剪切→拼接→导入→表达
苏云金芽孢杆菌（抗虫基因）
棉花细胞
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
载体
重组DNA分子技术的基本工具：
1.DNA都是四种脱氧核苷酸组成的；都是规则的双螺旋结构；都遵循碱基互补原则
2.基因是控制生物性状的结构与功能单位
3.遗传信息传递都遵循中心法则
4.生物界几乎共用一套遗传密码
3.基因工程的理论基础
拼接的基础
表达的基础
下列对基因工程的理解，正确的是( )
①它是一种按照人们的愿望，定向改造生物遗传特性的工程
②对DNA进行人为删减或增添某些碱基
③是体外进行的人为的基因重组
④基因工程又叫重组DNA技术
⑤在DNA分子水平上进行操作
A.①②③④⑤ B.①③④⑤
C.①③⑤ D.①②③⑤
及时练：
B
一. 限制性内切核酸酶 —— “分子手术刀”
1. 来源：
主要从原核生物中分离纯化来的
3. 种类：
数千种
注意：限制酶不是一种酶，而是一类酶。
2. 简称：
限制酶
4. 功能:
能够识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
“两个特定”：说明限制酶具有专一性
A
T
G
C
腺嘌呤
胸腺嘧啶
胞嘧啶
鸟嘌呤
4种
脱氧核苷酸种类：
【回顾】
DNA的基本单位：
脱氧（核糖）核苷酸
DNA中文全称：
脱氧核糖核酸
一条脱氧核苷酸链
…
（3 ’、 5’）磷酸二酯键
5′
5′
3′
3′
A
P
脱氧
核糖
G
P
脱氧
核糖
T
P
脱氧
核糖
C
P
脱氧
核糖
脱氧
核糖
G
P
A
P
C
P
T
P
脱氧 核糖
脱氧 核糖
脱氧核糖
氢键
DNA的平面结构
一端有一个游离的磷酸基团
另一端有一个羟基（—OH）
5.作用部位
磷酸二酯键（详细：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开）
A
T
C
G
T
A
G
C
5’
3’
5’
3’
磷酸二酯键
*限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键
断开部位
磷酸二酯键的形成过程——脱水缩合
6.识别序列
大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或 的核苷酸组成
6
4
8
其他数量
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T- A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
BamHⅠ
5’…G-G-A-T-C-C…3’
3’…C-C-T- A-G-G…5’
TaqⅠ
5’……T-C- G-A……3’
3’……A-G- C-T……5’
限制酶所识别的序列的特点是：
即：一条链正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致
①都可以找到一条中心轴线
②中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列
5’…T-C-G-A…3’
3’…A-G-C-T…5’
1. 下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A.
B.
C.
D.
5’-GAATTC -3’
3’-CTTAAG- 5’
5’-GGGGCCCC-3’
3’-CCCCGGGG- 5’
5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC- 5’
5’-CTAAATC-3’
3’-GATTTAG- 5’
D
现学现用：
一. 限制性内切核酸酶 —— “分子手术刀”
7. 结果：
产生黏性末端或平末端
黏性末端
平末端
实例2——SmaⅠ限制酶切割
平末端
实例1——EcoRⅠ限制酶切割
黏性末端
黏性末端
在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开
在它识别序列的中心轴线处切开
EcoR Ⅰ
2个相同（互补）黏性末端
识别序列：GAATTC
切割部位：GA之间的磷酸二酯键
形成黏性末端（从5’往3’读）：AATT
实例1—EcoRⅠ限制酶：
EcoR Ⅰ
Sma Ⅰ
沿中轴线两侧切
2个相同（互补）黏性末端
识别序列：GAATTC
笔记
回文序列
若一个限制酶切割一次
可断开 个磷酸二酯键
①形成 个相同（互补）的黏性末端
消耗 分子水
②形成___个游离的磷酸基团
2
2
2
2
黏性末端特点
③产生___个切口
1
Sma Ⅰ
2个相同平末端
实例2—SmaⅠ限制酶：
识别序列:CCCGGG
切割部位:CG之间的磷酸二酯键。
中轴线
EcoR Ⅰ
Sma Ⅰ
2个相同平末端
识别序列:CCCGGG
沿中轴线切
笔记
若一个限制酶切割一次
可断开 个磷酸二酯键
①形成 个相同平末端
消耗 分子水
②形成___个游离的磷酸基团
2
2
2
2
平末端特点
③产生___个切口
1
EcoR Ⅰ
Sma Ⅰ
笔记
①断开2个磷酸二酯键
②产生2个游离的磷酸基团
③消耗2分子水
切一次
④产生1个切口
1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？
可产生几个黏性末端？
切两个切口，产生四个黏性末端。
2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端或平末端
3.限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。限制酶只能识别并切割特定的双链DNA分子。
相关思考
【探究】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
GATC
AATT
AGCT
GATC
【思考】
同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
限制酶总结：
1.限制酶：是一类酶，不是一种，主要来源于原核生物，作用于磷酸二酯键。
2.限制酶具有专一性：
3.限制酶切割结果：
4.黏性末端：不同的限制酶可能产生相同的黏性末端
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列
切割每条链特定部位的磷酸二酯键
产生黏性末端（中轴线两侧切开）
产生平末端（中轴线处切开）
5’…G
3’…C-C-T-A-G
5’…T-C-G-A…3’
①
②
③
3’…A-G-C-T…5’
-G-A-T-C-C…3’
-G…5’
-C
-GTTAA-
再来一个：写出限制酶切割后的片段补充完整
旁栏思考题：
1.根据来源推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？（P71）
2.试推测限制酶为什么不会切割细菌自身的DNA*？（P74）
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，故其在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶是一种防御性工具，用于切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
含某种限制酶的细菌的DNA分子不存在该限制酶的识别序列或者识别序列被修饰（如：甲基化），使限制酶不能将其切开。
资料卡——限制酶名字的由来
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；
如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRⅠ。
小练习：
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______
SmaⅠ
思考.讨论：重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
产生缺口怎么办？
DNA连接酶
二. DNA链接酶 —— “分子缝合针”
1. 作用：
将双链 DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
2. 作用部位：
磷酸二酯键
①种类
②来源
③功能特性
④相同点
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
只能连接具有互补黏性末端的DNA片段
既可以连接互补的黏性末端，又可以连接平末端（连接平末端的效率相对较低）
恢复的被限制酶切开的磷酸二酯键
二. DNA连接酶 —— “分子缝合针”
3.E·coli DNA连接酶的缝合作用
两个双链DNA片段要具有互补黏性末端才能连接起来
把两个双链DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接两个双链DNA片段中的DNA单链缺口，但不能直接连接两条单链的DNA！
①
②
T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。
4.T4 DNA连接酶的缝合作用
DNA连接酶具有特异性吗？
DNA连接酶无识别特异性
GATC
AATT
AGCT
GATC
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
以DNA的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸加到已有脱氧核苷酸片段上形成单链
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用
作用结果
用途
催化形成磷酸二酯键
蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段上，形成磷酸二酯键
催化两个双链DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：
DNA连接酶和DNA聚合酶有区别吗？
区别：
1.DNA聚合酶：催化单个脱氧核苷酸加到已有脱氧核苷酸片段上，形成磷酸二酯键，需要模板
2.DNA连接酶：催化两个双链DNA片段之间形成磷酸二酯键。
相同点：
1.化学本质都是蛋白质
2.都催化形成磷酸二酯键
思考.讨论：重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
复习那些年学过的与DNA相关的几种酶
种类 作用底物 作用部位 形成产物
DNA连接酶
DNA聚合酶
限制酶
解旋酶
DNA分子片段
游离脱氧核苷酸
DNA分子
DNA分子
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
重组DNA分子
形成DNA的一条链
含黏性末端或平末端的DNA片段
单链DNA
注意：DNA（水解）酶：水解DNA的酶。包括彻底水解和不完全水解
限制酶
DNA连接酶
解旋酶
DNA聚合酶
试判断以上过程起作用的酶的名称
及时练
（1）通过基因工程产生的变异是不定向的 （　 　）
（2）限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列（　 ）
（3）DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 （　 　）
（4）E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端 （　 　）
（5）限制酶和解旋酶的作用部位相同 （ 　　）
判断常考语句，澄清易混易错
1.载体的作用是什么？载体是否就是质粒？若不是，载体有哪些种类？
2.外源基因要插入载体，载体需要具备什么条件
3.要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在并大量扩增，载体需要具备什么条件
4.肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件
阅读课本P72思考下列问题：
三. 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车”
1. 作用：
①将外源基因转入受体细胞。②使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达
2. 种类：
通常是用质粒。噬菌体、动、植物病毒也可以。
基因工程中的载体和载体蛋白是一回事吗？
基因工程的载体 载体蛋白
化学本质
作用
DNA分子
蛋白质
将外源基因送入受体细胞
运载需进出细胞的特定物质
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
①来源不同
②在大小、结构、复制方式有差别
③可插入外源DNA片段的大小有很大差别
不同载体的比较：
病毒能作为载体的原因：
病毒能感染细胞，并具有传送其基因组至靶细胞的能力。
三. 基因进入受体细胞的载体 —— “分子运输车”
3. 常用载体——质粒
质粒:是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
2.外源基因要插入载体，载体需要具备什么条件
有一个至多个限制酶切割位点
3.要使外源基因在受体细胞中稳定存在并大量扩增，载体需要具备什么条件
在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
目的基因
标记基因
复制原点
重组DNA分子
整合
导入
受体细胞
4.肉眼看不到携带外源基因的载体是否导入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件
具有特殊的标记基因
标记基因筛选原理
标记基因通常有:
①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
标记基因筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体携带目的基因导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。
在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
现学现用：
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来
1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为______
2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为______
①或②
①
*酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
3. 载体需具备的条件
①有一个至多个限制酶切割位点
②在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
③具有特殊的标记基因
④对受体细胞无害
供外源基因插入
使外源基因稳定存在且数量可以扩增
便于重组DNA分子的筛选
目的基因插入位点
复制原点
标记基因
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜
抗番木瓜环斑病毒基因提取
抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接
抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术的基本工具
基因工程的工具
限制酶
主要存在于原核生物中
具有专一性(特异性识别并切割DNA分子)
断开DNA分子的磷酸二酯键
DNA连
接酶
连接磷酸二酯键
主要种类
E.coliDNA连接酶：只缝合黏性末端
T4 DNA连接酶：缝合黏性末端和平末端
载体
具备的条件
①有一个或多个限制酶切位点
②能在宿主细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
③有特殊标记基因
④对受体细胞无害
载体类型：质粒（常用)、 噬菌体 、动植物病毒
（1）作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因 （　 　）
（2）质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体 （　 　）
（3）载体（如质粒）和细胞膜中的载体蛋白的成分相同 （　 　）
（4）作为载体，必须要有标记基因 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
现学现用：课后题拓展应用2
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）
思考：课后题拓展应用2
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶；同尾酶在构建载体时，使切割位点的选择范围扩大；
问题探讨
载体
目的基因
自身
环化
随意连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
1.将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有：
思考.讨论：重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
2.如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
使用两种不同的限制酶：①防止目的基因和载体的自身环化
②防止目的基因与载体的反向连接
问题探讨
双酶切
3.限制酶的选择原则？
问题探讨
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
思考讨论
1.只用一种限制酶切割目的基因和质粒的时候会出现什么现象？
（1）自身环化
（2）随意连接（反向连接）
2.双酶切时是否能用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ？
为什么？
四环素抗性基因
EcoR Ⅰ
Hind Ⅲ
BamH Ⅰ
不能
因为BamH Ⅰ会破坏质粒的标记基因，无法进行重组DNA筛选。同时BamH Ⅰ切割位点在目的基因上，也会破坏目的基因。
EcoR Ⅰ
Hind Ⅲ
BamH Ⅰ
DNA存在于细胞内部，如果要在体外对DNA进行操作，第一步应该怎么做？
将DNA提取出来，并进行鉴定
1.DNA粗提取的原理
DNA的粗提取与鉴定
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
①DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，DNA 能溶解在2mol/L的NaCl，而使杂质沉淀，以达到分离目的。
DNA的粗提取与鉴定
1.DNA粗提取的原理
2.DNA的鉴定原理
在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
DNA的粗提取与鉴定
1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
3.目的要求：
DNA的粗提取与鉴定
1）材料：新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料、
4.材料用具：
DNA的粗提取与鉴定
能否选用牛、羊、马、猪、兔等哺乳动物的红细胞做实验材料？
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
1）试剂：研磨液（P117）、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
4.材料用具：
DNA的粗提取与鉴定
1.SDS：使蛋白质变性与DNA分离
2.EDTA：一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA
3.Tris：稳定溶液pH，防止DNA在pH发生变化时降解或变性。
研磨液试剂缺乏时可用洗洁精和食盐代替
DNA的粗提取与鉴定
加洗涤剂（含SDS）的目的：裂解细胞膜，核膜，使蛋白质变性；
加入食盐的目的：使构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出DNA，并溶解DNA
1）试剂：研磨液（P117）、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。
4.材料用具：
DNA的粗提取与鉴定
相关试剂
析出DNA:______
溶解DNA:______________________
鉴定DNA:_______________;
体积分数为95%酒精
2mol/L 的NaCl溶液
二苯胺试剂
现配现用
5.方法步骤
取材、研磨
去除滤液中的杂质
析出DNA
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
研磨
称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。
DNA的粗提取与鉴定
研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(1)取材、研磨
思考：研磨不充分会导致什么情况？
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA的含量
②研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
注意：可加入纤维素酶、果胶酶（有利于充分研磨）
若利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法是什么
放入蒸馏水中让其吸水涨破
过滤取上清液
方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
DNA的粗提取与鉴定
(2)去除滤液中的杂质
目的：抑制DNA酶的活性，进而抑制DNA降解。
1、此过程滤纸能否代替纱布？
不能，使用滤纸会导致DNA吸附在滤纸上而大量损失
2、上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有蛋白质、RNA、多糖等杂质
析出DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
方法一：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
方法二：将溶液倒入塑料离心管中，10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
DNA的粗提取与鉴定
(3)析出DNA
2.为什么要沿一个方向搅拌？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
思考
1.酒精预冷的作用？
①可抑制DNA酶的活性，进而抑制DNA降解②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
DNA的鉴定
（4）DNA溶解与鉴定
1号试管 2号试管
加入2mol/L NaCl溶液 5mL 5mL
丝状物(DNA) 不加 加入
用玻璃棒搅拌 无 丝状物溶解
加入二苯胺试剂 4mL 4mL
沸水浴 5min 5min
观察现象 不变蓝 变蓝
空白对照组：
DNA的粗提取与鉴定
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
四、结果分析与评价
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有蛋白质、多糖等杂质。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
四、结果分析与评价
去除蛋白质
研磨过滤后，加嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）
将滤液置于60-75℃温度下一段时间（DNA80℃才变性）
进一步探究
本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。
例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿-异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。
进一步探究
本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
取材、研磨
去除滤液中的杂质
析出DNA
溶解DNA并鉴定
取材：DNA含量高，不能选用哺乳动物成熟的红细胞
研磨：研磨液中洗涤剂和食盐的目的。
DNA已溶解到NaCl中，因此上清液中含DNA，但还含蛋白质、多糖等杂质。
某些蛋白质溶于酒精，DNA不溶于酒精，沉淀物即为粗提取DNA。
提取出的DNA为沉淀物，故鉴定之前要将其在2mol/LNaCl中溶解，随后添加二苯胺水浴加热进行检测，若含DNA则显蓝色。

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