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第二章 细胞工程
第二节 动物细胞工程——动物细胞培养
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
怎样才能获得大量的自体健康皮肤？
能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、
扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
动物细胞工程常用技术
动物细胞培养（基础）
动物细胞融合
动物细胞核移植
1.概念
从动物体中 相关的____ ，将它_____________，然后在_____________ 下，让这些细胞_____和_____的技术；
2.原理：__________________
3.地位：__________________
4.结果：获得细胞或细胞产物
取出
组织
分散成单个细胞
适宜的培养条件
生长
增殖
细胞增殖（有丝分裂）
动物细胞工程的基础
一、动物细胞培养
思考：结合动物细胞培养的概念，思考其基本原理是什么？
1.机体给其体内的细胞提供了哪些适宜的条件使其能够维持正常的生命活动？
2.动物细胞培养实际上是模拟体内的生理条件来进行的，你认为体外培养动物细胞需要满足哪些条件呢？
动物细胞培养的条件
营养条件
其他条件
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
二、动物细胞培养的条件
1.营养
（1）培养基的构成：
将细胞所需的________（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按其_____和_______严格配制而成的培养基，称为___________
使用合成培养基时，通常需加入____ 等一些天然成分
为什么？_______________________________________
（2）培养基的物理性质
培养动物细胞一般使用 ，也称为______
营养物质
种类
所需量
合成培养基
血清
血清中含有多种未知的促细胞生长因子及
其他活性物质，可以补充合成培养基中缺乏的物质
液体培养基
培养液
二、动物细胞培养的条件
合成培养基+血清等天然成分
2.无菌、无毒的环境
①对 和 进行_____处理；
②在________下进行操作；
③还需要 _
培养液
所有培养用具
灭菌
无菌环境
定期更换培养液
目的：清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
在细胞培养液中添加一定量的抗生素抑制细菌的生长
二、动物细胞培养的条件
如何防止培养过程中的微生物污染？
3.温度、pH和渗透压
（1）适宜的温度
哺乳动物细胞培养的温度多以___________ 为宜；
（2）适宜的pH
多数动物细胞生存的适宜pH为________
（3）渗透压也是细胞培养的重要环境参数
维持适宜渗透压的目的______________________
36.5±0.5℃
7.2-7.4
维持细胞正常的形态和功能
二、动物细胞培养的条件
4.气体环境
（1）组成：动物细胞培养所需气体主要有___和____
（2）气体的作用
①O2：_____________________
②CO2：_________________________
（3）培养容器
通常采用_______或____________
（4）培养仪器
含有 和 的混合气体的__________
O2
CO2
O2是细胞代谢所必需的
CO2的主要作用维持培养液的pH
培养皿
松盖培养瓶
95%空气
5%CO2
CO2培养箱
二、动物细胞培养的条件
(1)培养前，为什么要将组织分散成单个细胞
(2)怎样将组织分散成单个细胞
(3)细胞培养一段时间，分裂会受阻，这是什么现象
怎样解决这一问题
(4)尝试写出动物细胞培养的基本流程。
阅读课本P44-45页，并思考以下问题:
二、动物细胞培养的过程
取动物组织
制成细胞悬液
进行
传代培养
转入培养液进行原代培养
分瓶
取动物组织
制成细胞悬液
进行传代培养
转入培养液进行原代培养
分瓶
二、动物细胞培养的过程
原因:
（2）制成细胞悬液：
用___________，或用______酶、_______酶 等处理的方法，将组织分散成________ ，然后，用______将细胞制成细胞悬液。
机械的方法
胰蛋白
胶原蛋白
单个细胞
培养液
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。
（1）取动物组织:
取材：
二、动物细胞培养的过程
（2）制成细胞悬液：
用___________，或用______酶、_______酶等处理的方法，将组织分散成________ ，然后，用______将细胞制成细胞悬液。
机械的方法
胰蛋白
胶原蛋白
单个细胞
培养液
思考1：将组织分散成单个细胞原因？
a.动物组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制生长和增殖；
b.使细胞与培养液充分接触，易于进行物质交换
二、动物细胞培养的过程
（2）制成细胞悬液：
用___________，或用______酶、_______酶等处理的方法，将组织分散成________ ，然后，用______将细胞制成细胞悬液。
机械的方法
胰蛋白
胶原蛋白
单个细胞
培养液
思考2：完成旁栏思考题：进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶行吗？
思考3：用胰蛋白酶处理动物组织时，是否要控制处理的时间，处理时间过长会怎样？
二、动物细胞培养的过程
（2）制成细胞悬液：
用___________，或用______酶、_______酶等处理的方法，将组织分散成________ ，然后，用______将细胞制成细胞悬液。
机械的方法
胰蛋白
胶原蛋白
单个细胞
培养液
思考2：完成旁栏思考题：进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶行吗？
动物细胞间的物质主要是蛋白质；
不可以；胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH＞6时，胃蛋白酶会失活，而多数动物细胞培养的适宜pH为7.2-7.4，胃蛋白酶在此环境中无活性，无法发挥作用
二、动物细胞培养的过程
思考3：用胰蛋白酶处理动物组织时，是否要控制处理的时间，处理时间过长会怎样？
使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
（2）制成细胞悬液：
用___________，或用______酶、_______酶等处理的方法，将组织分散成________ ，然后，用______将细胞制成细胞悬液。
机械的方法
胰蛋白
胶原蛋白
单个细胞
培养液
二、动物细胞培养的过程
（3）进行培养(原代培养）①操作过程：将________放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
细胞悬液
能够____在培养液中生长增殖。
悬浮
a.悬浮生长类：
b.贴壁生长类：
②体外培养的动物细胞分为两种类型
需贴附于某些____表面（如培养瓶壁）才能生长增殖。
基质
（主要类型）
原代培养：通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
a.悬浮生长类：能够悬浮在培养液中生长增殖。
b.贴壁生长类：需贴附于某些基质表面（如培养瓶壁）才能生长增殖。
特点:会因________过大、__________积累和培养液中_________缺乏等因素而分裂受阻。
细胞密度
有害代谢物
营养物质
体外培养的动物细胞分为两种类型：
细胞贴壁：细胞往往 ____在培养瓶的____的现象。
贴附
瓶壁
接触抑制：
当_____细胞生长到 时，细胞通常会_______________
贴壁
表面相互接触
停止分裂增殖
(4)传代培养(分瓶培养)
悬浮细胞
贴壁细胞
离心法收集
胰蛋白酶处理
制成细胞悬液
分瓶培养
二. 动物细胞培养的过程
思考2：离心的作用？
在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶
①收集细胞 ②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
思考1：此处用胰蛋白酶处理的原因是什么？
贴壁细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，将其分散到多个培养瓶中继续培养
取动物组织
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
细胞悬液
培养
分瓶
培养
①细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
② 接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
③原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿
培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
制成细胞悬液，分瓶培养
原代培养
传代培养
二、动物细胞培养的过程
贴附是有机体细胞在体内生存和生长发育的基本方式，包括细胞与细胞间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触。
正是基于细胞这种贴附生长的特征。使得不同细胞之间结合而形成组织，也使得细胞和周围环境之间保持联系。体外培养时，绝大多数细胞仍然保持了贴附生长的特性，必须贴附在某一固相支持物上如培养瓶壁上生长。
少数细胞(如来源于血液、淋巴组织的细胞以及某些肿瘤细胞)不需要贴附在支持物上。而是呈悬浮生长状态。
拓展
细胞“贴壁生长”的生物学意义
思考1：
是否接触抑制可以作为判断正常细胞和癌细胞的标志之一
由于接触抑制，正常情况下只能单层细胞
思考2：
癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
正常情况下，动物细胞培养的细胞是单层还是双层？
“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。
思考3：正常细胞能否一直传代培养下去？
不可以；
细胞的原代培养一般传至10代后就不易传下去，这时细胞能保持细胞正常的二倍体核型；
传代培养一般传至10-50代左右时，但少部分细胞遗传物质会改变，会克服寿命的自然极限，获得不死性，朝着等同于癌细胞的方向发展；
植物组织培养 动物细胞培养
原理
取材
培养基的物理性质
培养基特有成分
培养基特殊条件
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体植物器官、组织或细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
MS固体培养基
液体(又称培养液)培养基
植物激素（生长素和细胞分裂素）
动物血清
一、比较植物组织培养与动物细胞培养的异同
再分化需要光
气体环境
植物组织培养 动物细胞培养
过程
结果
相同点
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均是无菌操作，无菌培养
3.需要适宜的温度、pH等条件
发育成完整植株，可体现植物细胞的全能性
形成新的细胞群体，未体现动物细胞的全能性
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ）
一.概念检测
×
√
×
×
练习与应用（P47）
(1)动物细胞培养体现了动物细胞的全能性(　　)
(2)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞(　　)
(3)悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集(　　)
(4)动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH(　　)
×
√
判断正误
×
√
1.实验小鼠皮肤细胞培养的基本过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.甲过程需要在无菌条件下进行
B.乙过程可用胰蛋白酶处理皮肤组织C.丙过程是原代培养,会出现接触抑制现象
D.丁过程是传代培养细胞,不出现接触抑制现象
D
2.某研究小组为测定某药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞 (乙)进行动物细胞培养。下列叙述正确的是（ ） A.制备肝细胞悬液时，可用胰蛋白酶或胃蛋白酶处理肝组织块 B.恒温培养箱中的CO2浓度维持在10%左右，以维持培养液正常pH C.为了保证细胞培养所需的无毒环境，需大量添加各种抗生素
D.本实验应设置对照实验，以检测该药物对甲、乙的毒性大小
D
3.右图为动物细胞培养过程示意图，请回答以下几个问题：（1）容器A中的动物器官或组织首先要剪碎，然后用胰蛋白酶处理，其目的是______________________。（2）培养先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和__________等。当细胞分裂生长到 时，就会停止增殖，需用胰蛋白酶处理后分瓶继续培养，称为__________。（3）有一类不正常的动物细胞，体外培养不受接触抑制机制的制约而表现为“疯长”这类细胞最可能是__________。
动物血清
使细胞分散成单个细胞
表面相互接触
传代培养
癌细胞
第二章 细胞工程
第二节 动物细胞工程——动物细胞培养
（第2课时）
二、干细胞培养及其应用
1.分布：干细胞存在于 、______和_______等多种组织和器官中；
2.分类：干细胞包括 和 等
早期胚胎
骨髓
脐带血
胚胎干细胞
成体干细胞
早期胚胎
骨髓
脐带血
（1）胚胎干细胞（简称ES细胞）
①分布：存在于 中
②特点：__________________________________________
__________________________________________
③应用实例
早期胚胎
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能
ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等.
红细胞
血小板
各类白细胞
造血干细胞
（2）成体干细胞
①分布：存在于 中
②常见类别：包括_____中的 、________中的_________、____中的 等；
成体组织或器官内
骨髓
造血干细胞
神经系统
神经干细胞
睾丸
精原干细胞
（2）成体干细胞
③特点
__________________________________________
__________________________________________
一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中
注意：发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例
（2）成体干细胞
④应用实例：
通过造血干细胞的移植可以治疗白血病、遗传性血液病（如地中海贫血、血液再生障碍性贫血、镰刀状细胞贫血）等疾病。
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。主要由白细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，同时抑制正常造血功能所引起。
临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。
（2）成体干细胞
④应用实例：
神经干细胞：治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
①胚胎干细胞的局限性
胚胎干细胞必须从_____中获取 ，涉及________ ；
②诱导多能干细胞概念
通过体外诱导__________，获得 的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称_______
胚胎
伦理问题
成纤维细胞
类似胚胎干细胞
iPS细胞
（3）诱导多能（iPS）干细胞
③获取方法
①______________________________________
②______________________________________
③______________________________________
借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞
直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞
用小分子化合物来诱导形成iPS细胞
还可诱导已分化的T细胞、B细胞获得
（3）诱导多能干（iPS）细胞
思考：iPS细胞是否只能通过体外诱导成纤维细胞获得？
取成纤维细胞等
转入相关因子
细胞发生转化
神经元
iPS细胞
血细胞
胰岛细胞
移植
分化
肠上皮细胞
肝细胞
心肌细胞
④诱导多能干细胞优点
①诱导过程_____________
②iPS细胞可以 ，将它移植回病人体内后，理论上可以_________________；
⑤应用实例：
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
无须破坏胚胎
来源于病人自身的体细胞
避免免疫排斥反应
*因此，普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞
（3）诱导多能（iPS）干细胞
诱导多能干细胞（iPS细胞）——
类似于胚胎干细胞的一种细胞。
iPS细胞
多种体细胞
定向 诱导分化
体外诱导人的成纤维细胞
白血病、帕金森病、阿尔茨海默病等
治疗
转 化
1.关于ES细胞和iPS细胞及其应用的说法，正确的是( )A.ES细胞存在于早期胚胎中，能分化成各种功能细胞，不能形成生物个体B.ES细胞存在于成体组织和器官内，能分化成特定的组织C.iPS细胞存在于成体组织和器官内，能分化成特定的组织D.iPS细胞是人工诱导产生的，也可诱导分化成为各种组织细胞
D
及时练：
1.下列属于动物细胞培养与植物组织培养区别的是(　　)A.植物组织培养和动物细胞培养都体现了细胞的全能性B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行C.动物细胞培养可发生遗传物质改变，而植物组织培养不能D.动物细胞培养基与植物细胞培养基的成分有所不同
2.下列有关干细胞的叙述，错误的是( )A干细胞是具有分裂和分化能力的细胞B造血干细胞可定向诱导分化成机体所有种类的细胞C胚胎干细胞在饲养层细胞上培养能够维持不分化的状态D移植胚胎干细胞可使退化的组织得以修复并恢复正常功能
D
B
巩固诊断：
C
3.某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，若后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的 ( 　)A.用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性B.用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病C.如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术D.如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物
D
4.如图为细胞融合的示意图,下列叙 述正确的是( )A.若a细胞和b细胞是植物细胞，需先去分化再诱导融合B.c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因C.c细胞的形成只与a细胞膜的流动性有关D.a细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现

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