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第2节 微生物的培养技术及应用——
微生物的选择培养和计数(第1课时)
第1章 发酵工程
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）
讨论：
1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找
耐高温的酶
耐高温生物体
高温环境（热泉、火山口）
寻找
寻找
2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存
现学现用：
1.在被石油污染的土壤中可以筛选________ 微生物
2.在冰川冻土层可以筛选______微生物
3.漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是生活污水吗？___________
由以上例子可知，某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在这种条件下不能生存，因此可以通过这个原理从环境中获得某种特定种类的微生物。
实验室中微生物的筛选，可以应用这个原理吗？
石油分解
耐寒
不是
一、选择培养基
1.原理：
人为提供 _________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时 ___________________________。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
2.概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基
选择培养基应该如何进行配置？
3.举例：
（1）利用改变培养条件进行选择培养。
70～80℃的高温
分离耐高温的水生栖热菌
使用将pH调至酸性的培养基
分离耐酸菌
（2）利用营养条件进行选择培养
不加有机碳源的培养基
分离出自养型微生物
不加有机氮源的培养基
分离出固氮菌
（3）利用添加某种化学物质进行选择培养
加入青霉素
分离酵母菌、霉菌等真菌
思考·讨论 选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，
只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同
思考：
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性；
及时练：选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不加碳源的培养基、不加氮源的培养基、以尿素为唯一氮源的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是（ ）
A.硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B.根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C.异养型细菌、放线菌、硝化细菌
D.自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
D
1.方法
可采用 _____________ ；
2.方法概述
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行 ________，然后再将菌液_____到制备好的__________ 上；
两个基本操作：________ 和 ________
稀释涂布平板法
充分稀释
涂布
选择培养基
梯度稀释
涂布平板
二、微生物的选择培养
①铲取土样，将样品装入纸袋中
②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。
1ⅹ10
90mL无菌水
1ⅹ107
1ⅹ105
1ⅹ106
1ⅹ103
1ⅹ102
1ⅹ104
1mL
1mL
1mL
1mL
9mL无菌水
1mL
②取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
3.操作过程：
（1）梯度稀释
1mL
思考：此时稀释了多少倍
10倍(计算时，不要忽略)
（2）涂布平板
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注意：将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
待涂布的菌液被 __________后，将平板_____，放入___________中培养 ____d，在涂布有________ 菌液的平板上就可以观察到分离的_______ ；
培养基吸收
倒置
恒温培养箱
1-2
合适浓度
单菌落
（3）培养
注意：由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；
注：(1)涂布平板的所有操作均在酒精灯火焰旁进行。
(2)不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中,以免引燃酒精。
(3)在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时,要使菌液与水充分混匀。
实验设计方法分析
(1)设立重复组:在同一稀释度下,要至少涂布3个平板作为重复组,以增强实验结果的说服力与准确性。
(2)设立两种对照组
① 判断培养基中是否有杂菌污染,需同时将未接种的牛肉膏蛋白胨培养基和未接种的选择培养基进行培养。
② 判断选择培养基是否具有筛选作用,需同时设置已接种的牛肉膏蛋白胨培养基进行培养,观察两种培养基上的菌落数目,进行对比得出结论。
及时练：某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述，正确的是（ ）
A.实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉
B.只可利用平板划线法对细菌进行分离纯化并计数
C.培养基中含有的蛋白陈主要为细菌培养提供氮源和维生素等
D.观察细菌培养的实验时，最好是在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验
D
三、微生物的数量测定
（一）稀释涂布平板法——间接计数法
高
单菌落
样品稀释液
活菌
活菌
菌落
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目；
当样品的稀释度足够___时，培养基表面生长的一个____，来源于__________ 中的一个____；通过计数平板上的____ 数，就能推测出样品中大约含有多少_____；
1.原理
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
2.计数原则
（1）选择菌落数为 _______的平板计数；
（2）____稀释度下，应 ____ 对___个平板进行重复计数，
然后求出 ______ ；
3.结果分析
（1）统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ____ ；
原因：___________________________________
___________________________________
（2）统计结果一般用 _______ 而不是用活菌数来表示；
30-300
同一
至少
3
平均值
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
菌落数
（3）计算
C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；
V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；
M代表稀释倍数；
则每克样品中的细菌数=__________
（C÷V）×M
现学现用：
某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109
C. 234 D. 23.4
B
及时练：
1.统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目（ ）
2.统计菌落数目的理论依据是一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌（ ）


（1）方法：
利用特定的 ___________ 或 _____________ 在 ______ 下观察、计数，然后再计算 _________ 的样品中微生物的数量；
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
血细胞计数板常用于 _______________________________ 等的计数
相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子
细菌计数板可对 _________________ 进行观察和计数；
细菌等较小的细胞
（一）显微镜直接计数法——直接计数法
（2）优点：
快速直观
（3）缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
计数一个小方格内酵母菌数量，再以此为依据估计培养液中酵母菌总数。
1mL培养液中细胞个数＝
X
1mL
=
0.1mm3(10-4mL)
每小方格中细胞的个数×400
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题（实验目的）
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
3.实验步骤
（1）土壤取样
①取样地点要求：
酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
（3）样品的稀释与涂布平板
（稀释涂布平板法）
测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
注意事项：
本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
内容 现象 结果分析
是否有杂菌污染 对照组培养基上无菌落生长
对照组培养基上有菌落生长
选择培养基是否具有筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多余选择培养基上的菌落数目
样品的稀释操作是否成功 得到2个或2个以上的菌落数为30—300个平板
重复组的结果 若选取的是同一个土样，统计的结果应该
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
操作成功
接近
（5）结果与分析
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
（5）进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，
pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发
生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某
种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
培养基
选择培养基
鉴别培养基
：根据某种微生物的特殊营养要求配置。
：加入能与目的菌的代谢产物发生显色
反应的指示剂。
（作用）
平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理
接种工具
单菌落的获得
通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种环
涂布器
从最后划线的区域挑取
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
两种纯培养方法的比较
平板划线法 稀释涂布平板法
用途
接种效果图
相同点
分离纯化菌种，获得单菌落
①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的
1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
拓展应用
拓展应用
几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈
2. 已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细
的实验方案。
用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。

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