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(共30张PPT)
第3章 基因工程
3.1 重组DNA技术的基本工具
3.2 基因工程的基本操作程序
3.3 基因工程的应用
3.4 蛋白质工程的原理和应用
科技探索之路
操作环境及操作对象
原理
操作水平
结果
体外环境；基因
分子水平
概念
基因工程
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？
基因工程载体需要具备什么条件？
本节聚焦
1
2
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
【从社会中来】
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶：
DNA连接酶：
载体：
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
【从社会中来】
1.切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的；
2.限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开（核苷酸之间的磷酸酯键，深红色）；
T
G
C
G
T
A
C
G
C
A
5′
5′
磷酸二酯键
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3.大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；
4.DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（5 ′）黏性末端
5′
5′
平末端
5′
3′
5′
3′
中心轴线
EcoRⅠ
5′
3′
5′
3′
SamⅠ
01
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
资料卡
限制酶的命名
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
1.你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA
提示：微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期的演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
思考：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
作用
相同点 大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
恢复的都是磷酸二酯键
02
DNA连接酶——“分子缝合针”
1.DNA连接酶能够将DNA片段连接起来
2.基因工程常用的DNA连接酶有两种：
归纳总结
DNA连接酶和DNA聚合酶的比较
比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶
DNA连接酶
A
T
A
G
T
C
C
G
A
A
T
T
连接两个DNA片段
DNA连接酶作用示意图：
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
连接单个脱氧核苷酸形成单链
DNA聚合酶作用示意图：
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
归纳总结
与DNA相关的五种酶的比较
1.最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
DNA分子复制的起点
特殊的标记基因
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
03
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
2.载体需具备的条件
有一个至多个限制酶切割切点
作用：供外源DNA片段（基因）插入其中
能在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
作用：使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制
有特殊的标记基因
作用：便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无害
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
03
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.其他载体
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
03
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。
请你在上述序列中EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。
讨论：
1．剪刀和透明胶带分别代表哪种“分子工具”？
2．你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
3．你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
5′-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3′
3′-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5′
5′-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3′
3′-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5′
思考·讨论
重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
5′-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3′
3′-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5′
5′-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3′
3′-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5′
实验原理
1.DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
2.实验原理：
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液
在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
1．30g洋葱切碎＋10mL研磨液，充分研磨。
2．双层纱布过滤，4℃放置几分钟，取上清液。加入等体积冷酒精，静置2～3min，用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。
可替换操作：
1500r/min离心5min，取上清液。然后10000r/min离心5min，取管底沉淀物晾干。
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
3．2mol/L的NaCl 5mL＋丝状物或沉淀物。再加二苯胺试剂4mL混匀，沸水浴5min，冷却后观察到蓝色（不加DNA做对照）。
探究实践
DNA的粗提取与鉴定
视频演示：DNA的粗提取与鉴定
限制酶
DNA连接酶
载体
有一个至多个限制酶切割切点
能在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
有特殊的标记基因
对受体细胞无害
质粒、 噬菌体、动植物病毒
重组DNA技术的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位： 磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中,将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
C
A
练习与应用
一、概念检测
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
提示：迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。
细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，一是因为不具备限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开（DNA分子被甲基化保护）。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
练习与应用
二、拓展应用
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ。因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
练习与应用
二、拓展应用
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，扩大了切割位点的选择范围。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
练习与应用
二、拓展应用
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。

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