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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
一、微生物的基本培养技术
什么是培养基？如何配制？
什么是无菌技术？
本节聚焦
1
2
3
怎样进行酵母菌的纯培养？
微生物概述
微生物的概念：
_________________________的统称。
包括_______________________________等。
本章中提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
难以用肉眼观察的微小生物
细菌、真菌、病毒及一些原生生物
禽流感病毒
SARS病毒
大型真菌
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
酸奶
从社会中来
_____________，_______________________是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
防止杂菌污染
获得纯净的微生物培养物
实验室培养微生物条件
1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
——培养基的配制
2）确保其它微生物无法混入
——无菌技术
高压蒸汽灭菌
固体培养基
3）将需要的微生物分离出来
——微生物的纯培养
微生物在其表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。
培养基的配制
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
01
1.培养基概念：
2.培养基作用：
3.培养基类型：
固体培养基 液体培养基 半固体培养基
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
培养基成分明确
分类、鉴定
允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
天然培养基
合成培养基
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
选择培养基
鉴别培养基
补充：培养基的类型及用途
4.培养基的配方:
（1）基本成分：
水、碳源、氮源、无机盐。
碳源
无机碳源：
有机碳源：
氮源
NH4＋、NO3-、NH3等。
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。
CO2、CO32-、HCO3-。
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。
无机氮源：
有机氮源：
来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质
无机盐
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等
大量元素：
微量元素：
Ca、K 、Mg等
牛肉膏、蛋白胨：
自养微生物
异养微生物
为什么培养基需要氮源？
是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
01
培养基的配制
01
（2）特殊需求：
满足微生物对 的需求。
④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。
例如：①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；
②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；
③培养细菌时，需要将培养基调至 ；
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000ml 水
pH、特殊营养物质、O2
01
培养基的配制
4.培养基的配方:
牛肉膏
蛋白胨
1、下表为某培养基的配方,下列叙述正确的是( )。
从物理性质看该培养基属于液体培养基
该培养基中属于碳源的物质只有葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
该培养基缺少特殊营养物质
该培养基调节合适的pH后就可以直接接种使用
练习与应用
2、下列可以作为自养型微生物氮源的是( )。
A. N2、尿素 B.牛肉膏、蛋白胨 C.尿素、酵母粉 D.铵盐、硝酸盐
碳源、氮源、
特殊营养物质
碳源
调节pH
染色剂
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染！
使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。
（1）概念：
（2）常用的消毒方法：（教材11页“资料卡”）
①煮沸消毒： 100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒：针对一些不耐高温的液体；
62-65℃下处理30min 或 80-90℃下处理30s-1min。
③化学药剂消毒：用酒精擦拭双手、氯气消毒水源等。
④紫外线消毒：
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。
02
无菌技术
1.消毒
　　
（1）概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（2）常用的灭菌方法：湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌
芽孢
芽孢是某些细菌（如芽孢杆菌属）在营养条件缺乏时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞，它是有丝分裂或减数分裂的产物。
02
无菌技术
2.灭菌
孢子
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的
某些微生物的休眠体，基本保持培养基的营养成分不被破坏。
对象：培养基等。
注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
①湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15-30min。
高压蒸汽灭菌锅
（2）常用的灭菌方法：（教材11页“资料卡”）
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属用具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h。
　　
③灼烧灭菌：酒精灯火焰充分燃烧层灼烧
效果：最彻底
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具如涂布器、接种环、接种针，以及
接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。
（2）常用的灭菌方法：（教材11页“资料卡”）
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒
日常生活
100℃煮沸5～6min
巴氏消毒
不耐高温的液体
62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121 ℃,15～30min
接种室、接种箱，超净工作台
（3）比较：消毒与灭菌
两个方面：
消毒:
对操作的空间、操作者的衣着和手
灭菌:
培养细菌用的培养基与培养皿
玻棒、试管、烧瓶、吸管和接种环等
还要注意：
避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触；
为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。
02
无菌技术
超净工作台
纯培养物：
纯培养：
培养物：
将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体称为培养物。
有单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养
操作步骤：
念珠菌显色培养基
大肠杆菌培养基
酵母菌培养基
金黄色葡萄球菌和枯草杆菌培养基
03
微生物的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
1.菌落：
2.纯培养物：
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
03
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
3.原理：
1．制备培养基
配制培养基
灭菌
倒平板
培养基灭菌：高压蒸汽灭菌——121℃，气压100kPa，15-30min
培养皿灭菌：干热灭菌——160~170 ℃ ，灭菌2h
酵母菌的纯培养
倒平板
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
倒平板注意事项：
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
酵母菌的纯培养
平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
平板划线法
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
③试管口通过火焰
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
酵母菌的纯培养
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
平板划线法注意事项:
思考：若完成图示操作，共做了五次划线，接种环灼烧灭菌了几次？
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水；离开实验室时一定要洗手，以
防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免
污染环境。
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
3.培养酵母菌
酵母菌的纯培养
结果分析与评价：
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
提示：在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。
提示：如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
酵母菌的纯培养
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
评估论点的可信程度
思维训练
水果“酵素”是什么？
其制作原理是什么？
其中可能含有哪些成分？
其是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？
其中的所有成分都有益于人体健康吗？
“酵素”就是“酶”的另一种说法。
其制作是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。
其中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分。
不存在它独有的、特殊的营养物质。
其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。
因此，此论点值得怀疑。
课堂小结
一、概念检测
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制——降低食品的水分含量；
腌制——通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温储存——通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
二、拓展应用
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
练习与应用
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
二、拓展应用
练习与应用
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。

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