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第二章 细胞工程
第二节 动物细胞工程
动物细胞工程的发展历程
1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法。
1951年，张明觉等发现了哺乳动物精子获能现象
1959年，试管家兔诞生。之后，多种试管动物相继出生
1958年，格登用非洲爪蟾进行体细胞核移植实验，同期，我国科学家童第周开展了鱼类细胞核移植工作
1975年，米尔斯坦和科勒等创立了单克隆抗体技术
1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割。次年，科学家分割绵羊胚胎获得了同卵羔羊
1981年，埃文斯等成功分离和培养了小鼠的胚胎干细胞，1996年 克隆羊诞生
2006年，山中伸弥等获得了诱导多能干细胞，我国科学家用这种细胞培育了小鼠
2014年，世界上第一个用单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿在我国诞生
2017年，我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年，希普 胚胎移植技术
照片中两只可爱的小孩，分别叫“中中”和“华华”，它们于2017年诞生于中国，是世界首例体细胞克隆猴，轰动全世界！
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
通过细胞培养构建人造皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
从社会中来
一、动物细胞培养
培育的终点：细胞
1.概念：
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
2.目的：
获得细胞或细胞产物 （不能获得完整动物个体）
3.原理：
细胞增殖（有丝分裂）
那么，动物细胞的培养需要哪些条件呢？
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
动物细胞培养的条件
营养物质
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
1.动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等
合成培养基
（将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配置而成的培养基）
液体培养基
（培养液）
含有多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质，可以补充合成培养基中缺乏的物质
1.动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
(1)营养
(2)无菌、无毒的环境
无菌
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液，以便清除代谢物
无毒
超净工作台
1.动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
(3)适宜的温度、pH和渗透压
哺乳动物多以（36.5±0.5）℃
温度：
pH：
多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4
渗透压：
需要考虑的一个重要环境参数
O2:
细胞代谢所必需的
CO2：
维持培养液的pH
（95%空气和5% CO2 ）
CO2 培养箱
微生物培养中的作用不同（为自养型微生物提供碳源）
1.动物细胞培养的条件
一、动物细胞培养
(4)气体环境
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
细胞贴壁
接触抑制
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
2.动物细胞培养的过程
动物组织块
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
制成细胞悬液
原代培养
问题
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
接触抑制
解决
传代培养
分瓶
一、动物细胞培养
思考：1.选动物幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料的原因？
因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
思考：2.用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理组织块，使组织块分散成单个细胞的目的是什么？
①使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需的O2和营养物质的供应，另一方面保证细胞内代谢废物的及时排出；
②使得在细胞水平操作的其它技术得以实现。
思考：3.用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？
思考：4.胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？
主要是蛋白质(胶原蛋白等)。
能，应注意时间的控制。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间还会分解膜蛋白，对细胞造成损伤。
思考：5.能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？
不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
（1）细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。
（2）培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。
培养皿
培养瓶
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
瓶壁上的细胞层数是：一层（或单层）
贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。
（3）接触抑制
分瓶培养
解除方法
癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。
将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
（5）传代培养:
（4）原代培养:
在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
思考：6.用胰蛋白酶两次处理的目的是？
第一次处理的目的是使组织细胞分散开；
第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。
2.动物细胞培养的过程
一、动物细胞培养
取动物组织
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
①原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
②细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
③接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖的现象。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
加培养液
在培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
一、动物细胞培养
一、动物细胞培养
传代培养视频演示
一、动物细胞培养
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，増殖能力越强，所以更容易培养。
思考 讨论
一、动物细胞培养
2. 动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
培养结果
动物血清
植物激素
常用液体培养基
常用固体培养基
培养基性质
细胞的全能性
原 理
动物细胞培养
植物组织培养
比较项目
新的细胞群，不形成个体
完整植株
培养基特有成分
细胞增殖
思考 讨论
一、动物细胞培养
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基
培养基特有成分
过程
结果
相同点
固体培养基
葡萄糖、动物血清
液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
许多细胞
蔗糖、植物激素
①都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
新的植株
外植体
↓脱分化
愈伤组织
　 ↓再分化
芽、根或胚状体
↓生长发育
植物体
动物的组织
　　　　　 ↓ 机械法或胰蛋白酶、
↓ 胶原蛋白酶处理
细胞悬液
↓
原代培养
↓
细胞悬液
↓
传代培养
小结
(1)动物细胞培养体现了动物细胞的全能性(　　)
(2)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞(　　)
(3)悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集(　　)
(4)动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH(　　)
×
√
1.判断正误
×
√
即时训练
2.一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件
①无毒的环境　②无菌的环境　③只使用合成培养基　④温度与动物的体温相近　⑤因在CO2培养箱中培养，故不需要O2　⑥多数动物细胞培养在7.2～7.4的pH环境
A.①②④⑤⑥ B.①②③④
C.①②③⑤⑥ D.①②④⑥
√
即时训练
3.在将动物组织块分散成单个细胞时，可以使用胰蛋白酶。由此判断以下推测不合理的是
A.动物细胞之间可能依靠蛋白质相互联系
B.处理时一定要注意处理时间、加酶量
C.胰蛋白酶一定不会对动物细胞造成损伤
D.动物细胞培养液的pH应与胰蛋白酶作用的适宜pH基本一致
√
即时训练
干细胞简介
29
1.干细胞的概念：
2.干细胞的来源：
3.干细胞的类型：
动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。在一定的条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。
按分化潜能：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞
干细胞分类
按来源：胚胎干细胞、成体干细胞
干细胞培养及其应用
胚胎干细胞
简称ES细胞
心肌细胞
神经细胞
造血干细胞
分化
分化
分化
体外培养
1.干细胞的类型和特点
干细胞培养及其应用
早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
胚胎干细胞
分布
特点
应用实例
在体外分化成心肌细胞、
神经元细胞和造血干细胞等
局限性
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
ES细胞
电镜下的胚胎干细胞（照片经后期人工上色处理，放大约1500倍）
1.干细胞的类型和特点
干细胞培养及其应用
成体干细胞
造血干细胞
血细胞
神经系统中
神经干细胞
精原干细胞
神经细胞
精原细胞
骨髓、外周血和脐带血中
睾丸中
分化
分化
分化
1.干细胞的类型和特点
干细胞培养及其应用
33
成体组织或器官内
造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）
神经干细胞（神经系统中）
精原干细胞（睾丸中）
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
成体干细胞
分布
举例
特点
应用实例
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
造血干细胞→
神经干细胞→
治疗细胞损伤造成的疾病
干细胞培养及其应用
2.干细胞的应用
干细胞有着自我更新能力及分化的潜能，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用
正常
干细胞
患者体内
受损的器官或组织
治愈疾病
修复或替换
移植
干细胞培养及其应用
从社会中来
【资料】
2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），并用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。
2.干细胞的应用
干细胞培养及其应用
37
通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞
①将特定基因或特定蛋白导入细胞
（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）
诱导多能干细胞
概念
制备方法
应用
优点
②用小分子化合物诱导形成。
①诱导过程无须破坏胚胎；
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
iPS细胞
2.干细胞的应用
干细胞培养及其应用
（1）iPS细胞的诱导及其流程
病人
各种类型的细胞
导入特定基因
导入特定蛋白
小分子化合物
成纤维细胞
T细胞
B细胞
iPS细胞
分化
取出
移植
2.干细胞的应用
干细胞培养及其应用
诱导多能干细胞
（iPS细胞）
多种体细胞
定向诱导分化
体外诱导小鼠成纤维细胞
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
iPS细胞的应用前景：
临床治疗人类疾病如：
白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
2.干细胞的应用
干细胞培养及其应用
（2）iPS细胞应用的优点
（1）诱导过程无需破坏胚胎
（2）iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥。
所以，科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。
取成纤维细胞等
转入相关因子
细胞发生转化
iPS细胞
分化
移植
2.干细胞的应用
干细胞培养及其应用
【学生活动】
你如何看待干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
干细胞的研究正在如火如荼地开展。虽然干细胞用于临床治疗还面临一些问题，如存在导致肿瘤发生的风险，但是我们相信，随之理论和技术的不断完善，干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
（2）iPS细胞应用的优点
2.干细胞的应用
干细胞培养及其应用
来源或存在 功能、特点 局限性
胚胎干细胞(ES细胞)
成体干细胞
诱导多能干细胞(iPS细胞)
早期胚胎
能够分化成为动物体内的任何细胞，并进一步形成组织、器官甚至生物个体
成体组织或器官，如造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等
体外诱导体细胞产生
能分化成为具有特定功能的细胞来治疗疾病。无须破坏胚胎，且避免免疫排斥反应。
具有组织特异性，能分化成特定的细胞或组织
不具有发育成完整个体的能力
需从胚胎中获取，涉及伦理问题，限制了它在医学上的应用
技术不成熟。
干细胞培养及其应用
一、概念检测
1. 判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
(1) 培养环境中需要O2，不需要CO2。( )
(2) 细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 ( )
(3) 培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。 ( )
(4) 培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。 ( )
练习与应用
×
×
√
即时训练
√
2. 干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是 ( )
A. 干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B. 造血干细胞可以分化为各种血细胞
C. 不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D. 由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
练习与应用
A
即时训练
二、拓展应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
(1)由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施？
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HA(Human Leukocyte Antigen，人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
即时训练
二、拓展应用
(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
即时训练
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
温故而知新：
意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。　　　　　
动物细胞融合技术
用发绿色荧光的染料标记小鼠细胞表面的蛋白质
用发红色荧光的染料标记人细胞表面的蛋白质
1970年荧光标记的人-鼠细胞融合实验模式图：
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
动物细胞融合技术
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞
细胞膜具有一定的流动性
1.概念：
4.结果：
2.原理：
3.诱导方式
物理法：电融合法
化学法：聚乙二醇（PEG)
生物法：灭活病毒诱导法
与植物原生质体融合的方法相同
——动物细胞融合特有
动物细胞融合技术
病毒颗粒
灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面
细胞膜融合
细胞核融合
形成杂交瘤细胞
在病毒的作用下细胞膜打开
动物细胞融合技术
灭活病毒诱导细胞融合的原理
【拓展】
灭活：指用物理或化学手段使病毒失去感染能力（不感染细胞）
但是并不破坏病毒的抗原结构（诱导细胞融合）
5.过程:
动物细胞融合
动物细胞培养
细胞膜的流动性
细胞增殖
动物细胞融合技术
正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞
7.应用：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
6.意义：
至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。
研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
为制造单克隆抗体开辟了新途径。
动物细胞融合技术
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
融合前处理
诱导融合的方法
意义和用途
克服远源杂交的障碍，
获得杂种植株
细胞膜的流动性
细胞膜的流动性
植物细胞的全能性
去除细胞壁后诱导原生质体融合
使细胞分散后诱导细胞融合
物理（电融合法、离心法）
化学（聚乙二醇融合法、高Ca2+-高pH融合法）
物理（电融合法）
化学（聚乙二醇（PEG）2融合法）
生物方法：灭活的病毒诱导法
制备单克隆抗体
单克隆抗体及其应用
要制备单克隆抗体，就需要找到一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞。
什么细胞能产生抗体？
能产生抗体的细胞能否大量无限增殖？
什么细胞具有无限增殖的能力？
能否培养出一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞？
单克隆抗体及其应用
浆细胞
能产生抗体
骨髓瘤细胞
能无限增殖
单克隆抗体及其应用
1抗原
传统抗血清
（所有抗体混合）
免疫
1
1
2
3
4
缺陷：产量低、纯度低，特异性差。
（不能无限增殖）
动物体内
1抗原
注射
浆细胞
1抗体
1B淋巴细胞
增殖分化
传统抗体制备方法及缺陷
1
1.单克隆抗体的过程：
单克隆抗体及其应用
产量低、纯度低，而且特异性差
B淋巴细胞
不能无限增殖？
单克隆抗体及其应用
把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。
米尔斯坦
【英国】
科勒
【德国】
单克隆抗体及其应用
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞
（能无限增殖）
一种B淋巴细胞
（只分泌一种特异性抗体）
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
1975年，米尔斯坦和柯勒
1984年，诺贝尔生理学或医学奖
单克隆抗体及其应用
单
克 隆
抗 体
一个B淋巴细胞
细胞群
抗体
克隆
动物细胞融合
杂交细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
骨髓瘤细胞
（能无限增殖）
一种B淋巴细胞
（只分泌一种特异性抗体）
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体
单克隆抗体及其应用
单克隆抗体及其应用
1.单克隆抗体的过程：
注射特定的抗原
多种B细胞
培养骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞
将骨髓瘤细胞和B细胞融合
多种杂交细胞
杂交瘤细胞
（既可以大量增殖又能产生抗体）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能和特定的抗原结合）
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
诱导融合
单克隆抗体及其应用
注射特定抗原
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
1.单克隆抗体的过程：
单克隆抗体及其应用
2
杂交瘤细胞(多种)
1
3
置于选择性培养基上培养
第一次筛选
融合的细胞
BB
1
3
2
B
B瘤
瘤瘤
瘤
√
1.单克隆抗体的过程：
单克隆抗体及其应用
1.单克隆抗体的过程：
单克隆抗体及其应用
克隆化培养
抗体检测
第二次筛选
(抗原-抗体杂交技术)
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
阳性细胞
杂交瘤细胞(多种)
1.单克隆抗体的过程：
单克隆抗体及其应用
体外培养
单克隆抗体
体内或体外培养
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔
【两次筛选的比较】
项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）
筛选原因
筛选方法
筛选结果
诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合的细胞等。
用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
得到杂交瘤细胞
因为小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞
得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
单克隆抗体及其应用
1.单克隆抗体的过程：
单克隆抗体及其应用
培养杂交瘤细胞的方法比较
项目 腹腔培养 体外培养
优点
缺点
易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低
规模小，产量少
可大规模培养，大量生产
需要人为控制培养条件，成本相对较高
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识別的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
单克隆抗体及其应用
2.单克隆抗体的应用：
单克隆抗体及其应用
（1）诊断试剂——最广泛应用
抗原-抗体杂交法
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
在妊娠第8天就可以作出诊断，
比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
诊断优点：
2.单克隆抗体的应用：
单克隆抗体及其应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
血型检测试剂
新冠病毒检测试剂
（1）诊断试剂——最广泛应用
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC（抗体-药物偶联物）
2.单克隆抗体的应用：
单克隆抗体及其应用
主要用于癌症治疗。
优点：位置准确、疗效高、副作用小
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
（2）运载药物
2.单克隆抗体的应用：
单克隆抗体及其应用
（2）运载药物
单克隆抗体+同位素（荧光标记）
在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
结合荧光标记的单克隆抗体药物
（3）治疗疾病
医药领域，单抗类药物占用重要地位
一、概念检测
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
练习与应用
C
即时训练
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
练习与应用
A
即时训练
练习与应用
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,日前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。
即时训练
01
4.种类：
胚胎细胞核移植：
体细胞核移植：
细胞分化程度低，表现全能性容易
细胞分化程度高，表现全能性十分困难
3.生殖方式：
1.概念：
将动物一个细胞的细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。
用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。
2.原理：
动物细胞核的全能性
无性生殖
难度小
难度大
体细胞核移植技术
01
体细胞核移植技术
①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其____前的功能状态，这导致了_____________；
胚胎发育率低
②对非人灵长类动物_____进行操作的技术尚不完善
胚胎
分化
5.非人灵长类动物体细胞核移植的困难原因
具有许多与人类相似的生物学特征的灵长类动物
2017年我国培育世界上
首例体细胞克隆猴
01
体细胞核移植技术
将胚胎移入受体(代孕)母牛体内
6.过程
01
体细胞核移植技术
【思考 讨论】
体积大、营养多、容易操作；
营养物质丰富，为发育提供充足营养
含有促使细胞核表达全能性的物质
高产奶牛(供体)
因为10代以内的细胞
保证了供体细胞正常的遗传基础
为何选用MⅡ卵母细胞
问
一般选用10代以内的细胞，为什么？
问
采集卵母细胞，体外培养至MⅡ期
01
体细胞核移植技术
通过显微操作去核
梯度离心
紫外光短时间照射
化学物质处理
使DNA变性失活，达到去核的目的。
没有刺破卵母细胞膜，对卵母细胞伤害小。
纺锤体——染色体复合物
卵母细胞去核的原因是什么？方法是什么？
问
为使核移植动物的核遗传物质全部来自供体的细胞；
并防止细胞染色体的数量发生变化
方法：显微操作法
01
将供体细胞注射入去核的卵母细胞
将供体细胞整个注入去核卵母细胞中的原因？
问
对卵母细胞损伤较小；
保证供体细胞的细胞核不被破坏， 操作方便。
体细胞核移植技术
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01
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。
重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完成个体的能力。
什么是重构胚？处理重构胚的目的是什么？
问
用物理或化学方法（电刺激、Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程
将胚胎移入受体
(代孕)母牛体内
克隆犊牛
体细胞核移植技术
01
重构胚
克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？
为什么？
问
克隆动物遗传物质
细胞核的DNA
来自于供体动物的细胞核
线粒体中的DNA
供体细胞和卵母细胞
生活环境：
性状
可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异
出生与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
体细胞核移植技术
01
早期胚胎培养
动物细胞培养
胚胎移植
动物细胞融合
重构胚
早期胚胎
通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞
用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内
采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期
去核的卵母细胞
供体细胞培养
将供体细胞注入去核的卵母细胞
通过显微操作去核
高产奶牛（供体）
从供体身体的某一部位（如耳）上取体细胞
生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛
该过程中应用到了哪些技术？
动物细胞核移植
动物细胞培养
动物细胞融合
早期胚胎培养
胚胎移植
动物体细胞的细胞核具有全能性
问
该技术证明了什么？
问
体细胞核移植技术
01
加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。
1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。
1.应用前景
（1）在畜牧生产中
体细胞核移植技术
01
（2）医药卫生领域：
A.利用此技术培育的转基因克隆动物，可作为生物反应器生产珍贵的医用蛋白。
乳腺生物反应器
1.应用前景
体细胞核移植技术
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（2）医药卫生领域：
B.治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官，可作为异种移植的供体。
治疗性克隆
1.应用前景
体细胞核移植技术
（2）医药卫生领域：
C. 患者的核移植胚胎干细胞经过诱导分化，能形成相应的细胞、组织或器官可用于移植以避免免疫排斥反应。
1.应用前景
体细胞核移植技术
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①研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；
②克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因；
③克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。
（3）在科研领域：
（4）在保护濒危物种方面：该技术有望增加濒危物种的存活数量
1.应用前景
体细胞核移植技术
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2、存在的问题
（1）成功率低：
克隆胚胎移植成功率平均不到10%
许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷、免疫缺陷等。
需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合；
（3）健康问题：
（2）理论研究较为滞后：
体细胞核移植技术
01
体细胞核移植技术
2003年，世界上第一只用体细胞克隆的动物——多莉，因患有严重的肺部疾病被实施了安乐死。它只活了7岁，而普通绵羊的平均寿命在12岁左右。多莉的死亡引发了关于克隆动物是否早衰的争论。一些研究者认为，克隆动物的端粒比较短，基因表达不正常，早衰是一种必然现象。另一些研究者则认为，克隆动物的遗传物质是正常的，目前发现的早衰迹象是在克隆过程中的一些技术问题造成的;或者克隆动物在发育过程中出现了变异，早衰只是偶然现象。
【拓展应用】P55
1. 假设世界上最后一头野驴刚死亡，以下使它"复生"的方案中
可行的是（ ）
A. 将野驴的基因导入家驴的受精卵中，培育出新个体
B. 将野驴的体细胞取出，利用组织培养培育出新个体
C. 将野驴的体细胞两两融合，再经组织培养培育出新个体
D. 将野驴的体细胞核移植到家驴的去核卵母细胞中, 经孕育培育出新个体
D
一、概念检测
2. 2017年，某国批准了首例使用细胞核移植技术培育"三亲婴儿"的申请。其培育过程可选用如下技术路线。据图分析下列叙述错误的是（ ）
C
A. 该技术涉及动物细胞培养、细胞核移植等操作
B. 该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代
C. 卵母细胞捐献者携带的红绿色盲基因能够遗传给"三亲婴儿"
D. "三亲婴儿"同时拥有自己父亲、母亲及卵母细胞捐献者的部分基因
一、概念检测

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