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(共33张PPT)
从社会中来
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。一般家庭自制酸奶可能会导致肠胃不适，主要原因是有杂菌混入。 那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
这需要应用无菌技术和微生物的培养技术。
微生物概述
1.概念：
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
原核生物 (细菌、蓝细菌等)
原生生物 (如草履虫、衣藻等)
真菌 (如酵母菌、霉菌等)
病毒
新冠病毒
细菌
草履虫
酵母菌
2.种类：
3.研究和应用微生物的前提（也是发酵工程的重要基础）：
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物
4.实验室培养微生物的条件：
①要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
②要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
微生物概述
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，即培养基。
一、培养基的配制
2.作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3.类型：
固体
培养基
液体
培养基
有 无 琼脂
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养、
工业生产
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
1.概念：
划分标准 培养基种类 特点 用途
物理性质
化学成分
用途
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂
工业生产
观察微生物的运动、
分类鉴定
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
用已知的化学物质配制
分类、鉴定
在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类微生物
选择培养基
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
天然培养基
合成培养基
鉴别培养基
培养基的类型及用途
培养基中加氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
选择培养基
培养基+氨苄青霉素
培养基
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
4.培养基的营养构成：
⑴基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐。
①碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
（自养微生物的碳源）
（异养微生物的碳源）
②氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。
③无机盐：
Ca、K 、Mg为大量元素
Zn、Cu、Mn、Mo等微量元素
凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。
一、培养基的配制
特殊营养物质：
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
（天然物质牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）
⑵还需满足微生物对pH、特殊营养物质、氧气的需求。
①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；
②培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性；
③培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性；
④培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。
一、培养基的配制
牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
①培养自养型微生物，通常需要提供无机碳源，如CO2、NaHCO3等；
而培养异养型微生物，则需要提供有机碳源，如糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等。
②如果培养基里没有有机碳源，则通常培养的是自养型微生物；若含有有机碳源，则通常的为异养型微生物。
③微生物需要量最大的是碳源，最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；
最常用的无机氮源是铵盐和硝酸盐。
④对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源和能源。⑤某些微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成生长因子所需要的酶或合成能力有限。
⑥琼脂在培养基中仅作为凝固剂，不能为微生物提供能量和营养。
培养基的配制小结
二、无菌技术
1.获得纯净的微生物培养物的关键：
防止杂菌污染
2.无菌技术手段：
主要包括消毒和灭菌。
⑴对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
⑵将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
思考：无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
还能有效避免操作者被微生物感染。
3.消毒
⑴概念：指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
⑵常用的消毒方法
①煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：62～65℃下消毒30 min或80～90℃处理30s～1min。
适合一些不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分。
③化学药剂消毒法:用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
④紫外线消毒法：接种室、接种箱或超净工作台在使用前可以用紫外线照射30min，以杀死物体表面和空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
二、无菌技术
生物消毒法：P10相关信息
4.灭菌
⑴概念：指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
①芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
②孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
二、无菌技术
a.原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。
①湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121 ℃下维持15-30min
⑵灭菌的方法：
二、无菌技术
C.对象：培养基等。
b.优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
b.对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器)
金属用具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h
a.原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等。
⑵灭菌的方法：
二、无菌技术
③灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
c.效果：最彻底
b.对象：接种工具,如接种环、接种针；
试管口、瓶口等易被污染的部位。
a.原理：使微生物燃烧
⑵灭菌的方法：
二、无菌技术
传统发酵通常直接利用原材料中天然酵母菌
工业生产通常使用人工选育的高活性酿酒酵母
如何获得纯种酵母菌？
三、微生物的纯培养
1.培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体成为培养物。
（一）相关概念：
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
3.菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
（注：菌落属于种群；不同菌落的大小、形状、隆起程度、颜色等不同）
2.纯培养物、纯培养：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
（二）纯培养的步骤
配制培养基、灭菌、
接种、
分离和培养
三、微生物的纯培养
三、微生物的纯培养
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
1.制备培养基
（三）酵母菌的纯培养
⑴配制培养基
如果需要调节培养基的pH，应该在定容完成之后，灭菌之前进行操作。
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
培养基：用高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌
培养皿：在干热灭菌箱内干热灭菌
⑵灭菌
三、微生物的纯培养
1.制备培养基
（三）酵母菌的纯培养
⑶倒平板：待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
①拔出锥形瓶的棉塞
②将瓶口迅速通过火焰
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖
倒平板的具体操作步骤：
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置
三、微生物的纯培养
1.制备培养基
（三）酵母菌的纯培养
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
目的：既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。
2.接种和分离酵母菌
⑴原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
⑵“平板划线”类型
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
连续划线
分区划线
三、微生物的纯培养
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。
③试管口通过火焰。
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
⑶“平板划线法”实验操作
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线后,培养皿倒置培养
⑷平板划线法注意事项
分区划线法（最常用）
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
⑴为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
三、微生物的纯培养
⑵在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
⑶在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
三、微生物的纯培养
3.培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48h。
注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
三、微生物的纯培养
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染。
⑵在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
⑶你是如何记录实验结果的？
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加等。
4.结果分析与评价
⑴在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
三、微生物的纯培养
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用（p14）
一、概念检测
练习与应用（p14）
2. 日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制—降低食品的水分含量；
腌制—通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温储存—通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
一、概念检测
二、拓展应用
1. 某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有 。
培养皿和培养基
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
接种
练习与应用（p14）
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
二、拓展应用
1. 某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
练习与应用（p14）
2. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
二、拓展应用
意味着培养液中O2含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论？其原因是什么
培养液中O2含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。

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