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1.2.2
微生物的选择培养和计数
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
稀释涂布平板法
呈现的杂菌群
从社会中来
1. 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
美国黄石公园
那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？
一. 选择培养基
根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
2. 筛选原则
耐寒微生物
耐热微生物
石油分解菌
有利于目的菌生长的条件有哪些？
营养、温度和pH等
一. 选择培养基
⑴利用营养缺陷进行选择培养
*营养缺陷的微生物不能正常生长
⑵利用添加某种化学物质进行选择培养
*添加杀伤性物质，有抗性的可以生长，无抗性的死亡
⑶利用改变培养条件进行选择培养
*调节温度、pH等生长条件，只有适应的可以生长
1.概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
一、选择培养基
2.三种方法
类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温添加某种化学物质加入青霉素高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加氮源水生栖热菌酵母菌、霉菌等真菌金黄色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自养型微生物固氮菌一.选择培养基类型:
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素的细菌
加入青霉素：
不加氮源：
不加含碳有机物：
——分离出酵母菌、霉菌等真菌
(青霉素能杀死细菌、放线菌)
——分离出固氮菌
——分离出自养型微生物
分离土壤中分解尿素的细菌，怎么设计？
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
1.如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
设计一种选择培养基，用尿素为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
这种培养基与普通培养基相比，区别只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
思考·讨论 选择培养基配方的设计
选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件(如唯一氮源)，或加入某种物质(如青霉素) 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—亚甲蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
选择培养基与鉴别
微生物筛选过程中，除选择培养基外，另外还需设置两组对照培养基，以提高实验的说服力和科学性。
对照组 作用 现象 结论
未接种培养基 有无杂菌污染的判断 未接种的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
接种的全营养培养基 选择培养基有无筛选作用的判断 全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
微生物筛选过程中必要的两组对照培养基及其作用
原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此，能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株。
二、微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法——稀释涂布平板法。
准备工作：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
1.稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
2.实验的具体操作：
⑴土壤取样
铲取土样，将样品装入纸袋中。
取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。
⑵将10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
二、微生物的选择培养
2.实验的具体操作：
应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁操作。
1.将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
滴
2.取0.1ml稀释液，滴加到培养基表面。
灼
3.将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
涂
4.用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
浸
⑶取样涂布平板：
各梯度分别涂布3个平板，1个不涂布作空白对照。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃恒温箱中培养1～2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。
⑷培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
二、微生物的选择培养
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
⑴各操作细节要保证“无菌”，所有操作都应在酒精灯火焰旁进行。
⑵将涂布器浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
⑶操作中要注意防火。涂布结束后，应将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。
⑷10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略。
⑸由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证。
稀释涂布平板法操作的几点注意事项：
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作
接种工具
菌体获取
优点
缺点
接种环在固体平板培养基
表面连续划线
接种环
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
操作简单，可以根据菌落的特点
获得某种微生物的单细胞菌落
不能对微生物计数
①一系列的梯度稀释
②涂布平板操作
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
既可以获得单细胞菌落，
又能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
涂布器
共同点
都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征。
当样品的稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
1.原理：
2.计数原则：
一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。
间接计数法——稀释涂布平板法
每毫升样品中的菌株数=(C÷V) × M
3.计算公式：
三、微生物的数量测定
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)，M代表稀释倍数。
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 = 9×107个
三、微生物的数量测定
在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。
4.同一稀释度下平板数：
统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
5.统计结果：
统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
三、微生物的数量测定
三、微生物的数量测定
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数x400x104x稀释倍数
直接计数法——显微镜直接计数法
1.原理：
2.方法：
用计数板计算。
3.计算公式：
统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，造成统计值比实际值偏大。
4.结果分析：
5.缺点：
不能区分活菌与死菌
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂，且有一定误差
直接计数法和间接计数法
计算公式
每毫升原液含菌株数＝
每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数
每毫升原液含菌株数＝
平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数
1、显微镜直接计数：
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
不能区分死菌与活菌
不适于对运动细菌的计数
（比例计数法）
待测样品
等量的已知含量的红细胞
混匀
涂抹
测定：
红细胞数目
细菌数目
计算单位体积内的细菌数目
　 将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。
细菌
红细胞
2、显微镜直接计数是测定微生物的方法。
　　举例：已知红细胞浓度为M个/mL，从体积为N mL的大肠杆菌培养液中取出大肠杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？
X＝N×
M ×Y
W
(个)
观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数＝红细胞含量/细菌含量
公 式
一、课题目的
从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
二、研究思路
土壤取样
制备培养基
样品稀释与取样涂布
微生物的培养与观察
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1.土壤取样
⑴取样的位置：
2.制备培养基
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照，判断选择培养基是否具有选择作用。
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3 8cm的土壤层。
⑵取样要求：
取样时一般要铲去表层土。
3.样品的稀释与涂布平板
测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
⑴每个浓度至少设置4个平板：
1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复）：对土壤中分解尿素的细菌分离和计数。
4为牛肉膏蛋白胨培养基：用以判断选择培养基是否具有选择作用
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基；
以验证培养基中是否含有杂菌；
3.样品的稀释与涂布平板
另外，整个实验还要设置2个平板，是哪两个？目的？
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
⑵不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
⑶本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
3.样品的稀释与涂布平板
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
可以将稀释的范围放宽一点。例如可以将1×103-1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30-300的平板进行计数。
⑴培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30-370C温度下培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数。
4.微生物的培养与观察
⑵观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
⑶一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
5.结果分析
现象 分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有
选择作用
样品稀释操作成功的标志是什么？
得到2个或2个以上菌落数在30-300的平板
不一定，还需要进一步的鉴定
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1.原理：细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
2.方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
液体培养基可以直接看液体的变色情况；
固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带；
红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
课堂小结
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
结果分析
(1)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同(　　)
×
判断正误 P14
(2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数(　　)
(3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据(　　)
√
×
当两个或多个菌落连在一起时，只能观察计为一个菌落，因此利用稀释涂布平板法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少。
3.(多选)下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，正确的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后会
使酚红指示剂变红
√
√
典题应用 P16
4.(2023·江苏连云港高二期末)在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是
A.甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了
问题
B.将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，
可以证明培养基是否受到污染
C.让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，
则可以证明甲同学无误
D.B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则
√

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