资源简介

(共24张PPT)
细胞膜具有一定的流动性。
一、动物细胞融合技术
2.原理：
4.诱导融合常用的方法：
1.概念：
3.结果：
⑴灭活？
⑵灭活病毒诱导细胞融合的原理？
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
6.意义：
7.应用：
5.过程：
细胞膜融合→细胞质融合→细胞核融合（实质）
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用纤维素酶和果胶酶去细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
杂种细胞再生出新的细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制备单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较
抗原不纯
抗体不纯
缺陷：产量低、纯度低，
且抗体的特异性差、灵敏度低。
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
二、单克隆抗体及其应用
1.传统抗体制备方法及缺陷
科学家发现：体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上，每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体。
单
克 隆
抗 体
如何获得大量、单一的抗体？
遗憾：体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖。
如何解决？
二、单克隆抗体及其应用
抗体
一个
B淋巴细胞
细胞群
克隆
单克隆抗体：由单一B淋巴细胞克隆产生的特异性抗体。
二、单克隆抗体及其应用
单克隆抗体的制备思路
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
既能迅速大量增殖，又能产生抗体。
癌细胞
动物细胞融合
⑴我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的
⑵怎样使B细胞同时具备产生抗体和无限增殖能力？
思考：
注射特定的抗原
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞培养
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
多种杂交细胞
从小鼠的脾脏中获取
2.单克隆抗体的制备过程
二、单克隆抗体及其应用
置于选择性培养基上培养
2
1
3
第一次筛选
多种杂交瘤细胞
融合的细胞
骨髓瘤细胞
自身融合
B细胞自身融合
杂交细胞
1
3
2
未融合的B淋巴细胞
未融合的骨髓瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
特定的选择性培养基（HAT培养基）的筛选原理
①细胞合成DNA有两条途径，正常细胞内两种途径都有，若全合成途径被阻断，可以通过补救合成途径合成DNA；②骨髓瘤细胞不能合成转化酶和激酶，因此只能进行全合成途径；③全合成途径能被氨基喋呤（A）阻断；④次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）是补救合成途径的原料；⑤无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5～7天。将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周，则细胞生存状况及原因为：
①B细胞和B-B细胞死亡，能进行补救合成途径，但是无增殖能力；
②骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞死亡，两种途径均无法进行，无法合成DNA并增殖；
③杂交瘤细胞存活，能进行补救合成途径，能合成DNA并大量增殖。
第一次筛选:获得杂交瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
克隆化培养
抗体检测
第二次筛选
(抗原-抗体杂交技术)
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
阳性细胞
二、单克隆抗体及其应用
阳性孔
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养 （克隆化培养）
一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔 （抗体检测）
多孔细胞培养板
抗体检测板
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
第二次筛选:获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞
抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法
克隆化培养和抗体检测
★
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
有限稀释法
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
第二次筛选:获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞
注射到小鼠体内
体外培养
分离、提纯单克隆抗体
体内或体外培养
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
二、单克隆抗体及其应用
骨髓瘤细胞培养
杂交瘤细胞
单一抗体
阳性细胞
单克隆
抗体
细胞融合
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
融合
筛选
克隆
抗体检测 ， 筛选
脾脏中获取
单
克 隆
抗 体
第一次筛选 第二次筛选
原因
方法
结果
诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基进行筛选
用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
获得杂交瘤细胞
获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞
二、单克隆抗体及其应用
（1）该过程中应用到的技术
（2）原理
（3）注射特定抗原的目的？
（4）第一次筛选目的、筛选方法、筛选原理？
（5）杂交瘤细胞的特点？
（6）第二次筛选的目的、筛选方法、抗体检测原理？
（7）如何获取大量所需杂交瘤细胞？
（8）如何获取单克隆抗体？①体外培养？②小鼠腹腔内培养？
（9）单克隆抗体的优点？
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
二、单克隆抗体及其应用
1.分子水平的克隆：如DNA复制、PCR技术。
2.细胞水平的克隆：如细胞增殖、动物细胞培养。
3.个体水平的克隆：如植物组织培养、动物细胞核移植。
不同水平的克隆及实例
讨论1：ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
思考·讨论 单克隆抗体的应用
思考·讨论 单克隆抗体的应用
讨论2：除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
思考·讨论 单克隆抗体的应用
讨论3：
单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。
②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
⑴诊断试剂——最广泛应用
抗原-抗体杂交法
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
诊断优点：
准确、高效、简易、快速
3.单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
(主要用于癌症治疗)如：单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
⑵用于治疗疾病和运载药物
优点：位置准确、疗效高、副作用小
结合同位素的单抗
(“生物导弹”—单抗导向，药物为弹头)
3.单克隆抗体的应用
二、单克隆抗体及其应用
《课时作业》P103第6题
单克隆抗体
筛选二
杂交细胞
杂交瘤细胞
体外或
体内培养
筛选一
骨髓瘤
细胞
诱导融合
分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞群
提取
已免疫的
B淋巴细胞
动物细胞融合技术
动物细胞培养技术
单克隆抗体的制备
既能迅速大量繁殖
又能产生抗体
特异性强
灵敏度高
可大量制备
注射
抗原
练习与应用
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题 解决这些问题的大致思路是怎样的 这样做会有什么风险 请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。
练习与应用

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