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第2章 细胞工程
2.1 植物细胞工程
2.2 动物细胞工程
2.3 胚胎工程
细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
1.原理方法：
细胞生物学、分子生物学和发育生物学
2.操作水平：
细胞器、细胞或组织水平
3.目的：
获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品
4.分类：
植物细胞工程、动物细胞工程
细胞工程的概念
植物细胞工程发展历程
1902年，哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功
1958年，斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持
1960年，科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体
1964年，古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉粒发育而来的胚
1971年，卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株
1974年，土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合
第1节 植物细胞工程
第2章 细胞工程
从社会中来
“其芽葺葺，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨夫花开,凝晴瀼露,万态千妍,薰风自来,四坐芬郁,岂非入兰室乎!岂非有国香乎!”这是我国历史上第一部兰谱——《金漳兰谱》（宋·赵时庚）中对兰花的一段描述。从古至今，我国人民都把兰花看作高洁、典雅的象征，很多人喜欢兰花。但是，兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方法又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
国画作品—兰
利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。兰花是观赏植物中最常见的一类依靠植物组织培养繁育种苗的植物，其组培苗的数量约占观赏植物组培苗总量的40%。
一、植物组织培养技术
1.细胞的全能性
（1）概念：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。
（2）原因：一般来说，生物体的每个细胞中都含有发育成为完整个体所需的全部遗传信息。
（3）生物体生长发育过程中细胞不表现全能性的原因（不离体的细胞无法表现出全能性的原因）
在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。
一、植物组织培养技术
1.细胞的全能性
（4）细胞全能性的比较
①受精卵＞生殖细胞（卵细胞＞精子）＞体细胞；
②植物细胞＞动物细胞；
③幼嫩的细胞＞衰老的细胞；
④分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞；
⑤分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞。
一、植物组织培养技术
1.细胞的全能性
（5）实例—表现出全能性的例子
①利用菊花茎段培养获得试管苗；
②利用胡萝卜的韧皮部细胞培养获得胡萝卜幼苗；
③受精卵发育成个体；
④蜜蜂的孤雌生殖中，卵细胞直接发育成雄蜂；
⑤通过花药离体培养，获得单倍体幼苗；
⑥胚胎干细胞可分化发育成为各种组织器官的细胞；
①芽原基的细胞只能发育为芽，叶原基的细胞只能发育为叶；
②神经干细胞分化形成各类神经细胞；
③造血干细胞可分化形成多种血细胞；
（5）实例—未表现出全能性的例子
一、植物组织培养技术
1.细胞的全能性
（1）是不是所有的活细胞都具有全能性？
（2）种子发育成植株体现了全能性了吗？
（3）细胞具有的全能性一定能表现出来吗？
不是，例如哺乳动物成熟的红细胞、植物成熟的筛管细胞。
没有，植物种子种的胚已完成了早期发育，相当于新植物体的幼体，没有体现出细胞具有发育成完整植株的潜能。
不一定；例如动物的体细胞。
高度分化的植物组织细胞，如叶片和花瓣的细胞还能不能在适宜的条件下表现出全能性呢？
2.植物组织培养
（1）概念：指将离体的植物器官、组织或细胞（称为外植体）等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
（2）原理：植物细胞的全能性。
（3）过程：
外植体
脱分化
愈伤组织
再分化
芽、根
幼苗
完整植株
移栽成活
一、植物组织培养技术
2.植物组织培养
（4）重要概念—
①概念：
②实质：
③结果：
④光照条件：
⑤涉及的生命活动：
一、植物组织培养技术
已经分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变为未分化的细胞
形成愈伤组织
不定形的薄壁组织团块
脱分化
一般不需要光照
只有细胞增殖（有丝分裂），没有细胞分化
思考：若培养物取自植物的幼茎、叶片等含有叶绿体的部位，愈伤组织中是否会含有叶绿体？为什么？
否，培养物经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞，因此，愈伤组织中不含有叶绿体。
2.植物组织培养
（4）重要概念—
①概念：
②实质：
③结果：
④光照条件：
⑤涉及的生命活动：
一、植物组织培养技术
再分化
基因的选择性表达
再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株
需要给予适当时间和强度的光照,诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用。
既有细胞增殖（有丝分裂），又有细胞分化
3.菊花的组织培养
一、植物组织培养技术
生长素/细胞分裂素 结果
比值高(＞1)
比值低(＜1)
比值适中(=1)
（1）原理： ①植物细胞一般具有全能性；
②在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化和再分化，形成胚状体，长出芽和根等器官，进而发育成完整的植株；③植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向。
有利于根的分化，抑制芽的形成
有利于芽的分化，抑制根的形成
促进愈伤组织的形成
3.菊花的组织培养
一、植物组织培养技术
（2）材料分析：
①外植体：幼嫩的菊花茎段→容易诱导形成愈伤组织。
②体积分数为70%的酒精：对手、超净工作台、外植体进行消毒。
③质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液：对外植体进行消毒。
④无菌水：清洗外植体。
⑤培养基（参见本书附录1）包括无机营养成分（水和无机盐）、有机营养成分（蔗糖、氨基酸、维生素等）、特定浓度和比例的激素（主要是生长素和细胞分裂素）。
蔗糖的作用：
培养基灭菌方法为：
湿热灭菌法
提供能量，调节渗透压
（1）消毒
①用酒精擦拭双手和超净工作台台面。
②外植体→流水冲洗→酒精消毒30s→立即用无菌水清洗2～3次→次氯酸钠溶液处理30min→立即用无菌水清洗2～3次。
4.方法步骤
一、植物组织培养技术
思考：若想缩短消毒时间，可以怎么做？
适当提高次氯酸钠溶液的浓度
（2）外植体切段
将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中→用无菌滤纸吸去表面的水分→用解剖刀将外植体切成0.5～1cm长的小段。
4.方法步骤
一、植物组织培养技术
思考：为什么整个过程要保证无菌操作？
避免杂菌在培养基上迅速生长消耗营养，同时防止有些杂菌危害培养物的生长。
4.方法步骤
一、植物组织培养技术
（3）接种
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3～1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
接种时注意外植体的方向，不要倒插！
与生长素的极性运输有关；生长素含量多的部分容易生出不定根，含量少的部分生出不定芽，一般而言，容易长不定芽的是形态学上端，容易长不定根的是形态学下端，因此应该将形态学上端朝上，下端朝下，若倒插，外植体不易存活。
（4）脱分化
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18～22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
该过程一般不需要光照；
有光易形成维管组织，不易形成愈伤组织。
4.方法步骤
一、植物组织培养技术
（5）再分化
培养15～20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上→长出芽后→将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
先诱导生芽，再诱导生根；
每日需要给予适当时间和强度的光照！
4.方法步骤
一、植物组织培养技术
（6）移栽培养
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
4.方法步骤
一、植物组织培养技术
思考：整个过程中使用的培养基中，生长素/细胞分裂素的比值大小是如何变化的？
比值适中→比值低→比值高
（1）接种3～4d后，检查外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，有多少能正常生长，试分析它们被污染的原因。
5.结果分析与评价
用于植物组织培养的培养基同样适合某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。导致外植体被污染的原因可能有：培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等。
观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出了愈伤组织。从刚接种的外植体到长出愈伤组织一般需要2周左右的时间。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成芽和根的比例和时间。
一、植物组织培养技术
（2）你培养出愈伤组织了吗？如果培养出来了，从刚接种的外植体到长出愈伤组织经历了多少天？这些愈伤组织进一步分化出芽和根了吗？
（3）观察外植体的分化情况，填好结果记录表，并及时分析结果。
做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要做好实验记录，可以分组配制不同的培养基，如诱导愈伤组织的培养基、诱导生芽的培养基等，还可以进行不同配方的比较。
生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷酒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12h。掀开塑料薄膜24h后才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，待其长壮后再移植到大田或盆中。可以在课后统计移栽的成活率，看看移栽是否合格。
5.结果分析与评价
一、植物组织培养技术
（4）你培育的幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？
若想探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响，则应如何设计对照实验？
①空白对照：不加任何激素；
②实验组1：生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1；
③实验组2：生长素用量与细胞分裂素用量的比值大于1；
④实验组3：生长素用量与细胞分裂素用量的比值小于1。
6.进一步探究
一、植物组织培养技术
思考：能否从以上内容中概括植物组织培养中细胞表现出全能性所需要的条件？
（1）离体（最关键）
（2）严格的无菌条件
（3）适宜的培养条件
（4）适宜浓度和比例的激素
（5）一定的营养条件
①对操作环境、双手、外植体进行消毒；
②对培养基和器械进行灭菌；
③接种操作必须在酒精灯火焰旁进行。
①温度（例如菊花植物组织培养应为18-22℃）；
②光照（例如脱分化需避光，再分化需照光）。
植物激素的种类和含量不同，对愈伤组织的形成和分化的影响不同。
配制合适的培养基，包括有机营养成分、无机营养成分、适宜浓度和比例的激素。
若细胞不离体，细胞中的基因会选择性地表达，从而形成生物体的不同组织和器官，不能表现出全能性。
一、植物组织培养技术
7.植物组织培养中细胞表现出全能性的条件
1.过程
A细胞
B细胞
纤维素酶果胶酶
⑴去壁：
酶解法
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
⑵诱导融合
物理法：
化学法：
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法、
高Ca2+ —高PH融合法等
脱分化
再分化
移栽
植物体细胞杂交技术
植物组织培养技术
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
二、植物体细胞杂交技术
所用技术
1.过程
A细胞
B细胞
正在融合的原生质体
再生出细胞壁
脱分化
再分化
移栽
杂种植株
愈伤组织
A原生质体
B原生质体
移栽后的植株
二、植物体细胞杂交技术
⑴若只考虑两两融合，可形成几种融合细胞？符合要求的是？
⑵二倍体番茄和二倍体马铃薯杂交得到的“番茄—马铃薯”有几个染色体组？是几倍体？
3种（AA、BB、AB），符合要求的是AB。
4个，四倍体。
4.概念：
植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。
2.原理：
细胞膜具有一定的流动性
植物细胞的全能性
3.两个标志
（1）植物细胞融合完成的标志：
杂种细胞再生出新的细胞壁
（2）植物体细胞杂交完成的标志：
培育出杂种植株
5.实例：
白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等。
6.意义：
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
二、植物体细胞杂交技术
概念
植物细胞融合
去细胞壁
过程
变异类型
植物组织培养
再生成细胞壁
原理
原理
过程
花药离体培养
细胞全能性
操作步骤
脱分化
再分化
外植体
根、芽、胚状体
愈伤组织
外植体消毒
接种
切块
形成愈伤组织
诱导生芽生根
植物体细胞杂交
植物组织培养
植物细胞工程
优缺点
归纳总结
诱导原生质体融合
细胞全能性和细胞膜的流动性
染色体数目变异
练习与应用
一、概念检测
1.下图是利用甲、乙两种植物的各自优势，通过植物细胞工程技术培育
高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是（ ）
A.进行a处理时能用胰蛋白酶
B.b是诱导融合后得到的杂种细胞
C.c是培养后得到的具有耐盐性状的幼芽
D.进行d选择时要将植株种在高盐环境中
√
2.科学家在制备原生质体时，有时使用蜗牛消化道提取液来降解植物细
胞的细胞壁。据此分析，蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分
纤维素酶和果胶酶
主要原因是∶生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的。所以"番茄—马铃薯"杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。
"番茄—马铃薯"杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么
拓展应用

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