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(共31张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第三课时 DNA片段的扩增及电泳鉴定
目标
01
02
03
针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
（科学探究）
结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。（科学思维）
运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等（生命观念）
学习目标
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
利用PCR获取和扩增
目的基因、启动子、终止子、标记基因
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物);
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
温故知新：基因工程的基本程序
实验原理
材料用具
实验步骤
DNA体外扩增的原理
DNA片段电泳鉴定原理
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
一、实验原理
（一）DNA体外扩增的原理：
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
变性
90 C
延伸
72 C
退火
50 C
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
一、实验原理
电泳鉴定原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
（一）DNA体外扩增的原理：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
二、材料用具
（一）仪器：
PCR仪
微量离心管
电泳装置
微量移液器
自动控温，实现DNA的扩增
实际上是进行PCR反应的场所
用于向微量离心管转移PCR配方中的液体
包括电泳仪、电泳槽等
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
二、材料用具
（二）材料：
①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
③PCR反应体系的配方(见教材)
②电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
二、材料用具
三点提醒
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
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2
3
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
三、实验步骤
（一）DNA片段扩增的具体过程：
1
2
3
移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
三、实验步骤
（二）PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程：
制备凝胶
电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
①融化：
②倒模:
③凝固:
①加液：
②加样：
③电泳：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
三、实验步骤
（二）DNA片段的电泳鉴定：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
四、注意事项
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为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
问题1: 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
该片段大小约为750bp。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究.实验
问题2: 你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？
未出现扩增条带可能的原因有：
①TaqDNA聚合酶失活；
②引物出现质量问题；
③变性时温度低，变性时间短
④Mg2+浓度过低
出现非特异性扩增带可能的原因有：
①引物特异性不强或容易聚合成二聚体
②复性时的温度过低
③DNA聚合酶的浓度过高
④模板DNA出现污染
⑤Mg2+浓度过高
　实战训练　
1.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
　实战训练　
2.下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
A.该 DNA 最可能是线状 DNA 分子
B.两种限制酶在该 DNA 上各有两个酶切位点
C.限制酶 R1与 R2的切点最短相距约 200 bp
D.限制酶 R1与 R2的切点最长相距约 800 bp
　实战训练　
3.在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和 R2)处理某 DNA，进行凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，正确的是( )
课堂小结:基因工程的基本操作程序
⑴获取目的基因
人工合成
利用PCR
从基因文库
⑵构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
⑶将目的基因导入受体细胞
植物细胞、动物细胞、微生物细胞
⑷目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译
　实战训练　
4．聚合酶链式反应（PCR）能实现对相应核苷酸序列的大量复制，相关叙述正确的是（ ）
A．该技术需要用到引物、脱氧核苷酸、解旋酶等B．复性是为了使解旋后的两条链恢复双螺旋结构C．PCR的产物通常用抗原－抗体杂交技术进行鉴定D．为激活相应酶，PCR反应缓冲液中需加入Mg2+
　实战训练　
5．抗原检测阴性但临床仍然高度怀疑新冠病毒感染的患者，医生会建议做核酸检测。该检测实际采用的技术是 RT-PCR，病毒刺突蛋白编码序列如下图所示，科研人员为该PCR 分 别设计了引物 A ( 5’-CC C．TGTATGGGGTTCTAA - 3') 和 引物B(5'-ACG…ACT①TTA②CTGGTGCAG-3'),已知引物 A 中 ATG 对应起始密码子，引物B中 TTA 对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端。下列叙述正确的是（ ）
A．获取新冠病毒的遗传物质后直接进行 PCR 扩增以节省出报告时间B．若标记基因需要插入引物B的①或②位置中，则应选择②位置C．用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 PCR 后的产物，电泳结束后可在凝胶上直接观察到相应条带D．为避免杂菌污染，PCR 实验过程中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行干热灭菌
　实战训练　
6．氢键广泛存在组成细胞的化合物中，它的存在，影响到物质的某些性质。下列说法正确的是（ ）
A．水分子中氢键的存在使水具有较高的比热，不利于维持生命系统的稳定B．脱氧核苷酸链之间氢键的断裂一定会引起其所在DNA携带遗传信息改变C．在多聚酶链式反应的退火和复性过程中，伴随着氢键的断裂和重新形成D．氨基酸之间氢键断裂，不会影响蛋白质的空间结构和其结构决定的功能
　实战训练　
7．γ射线照射大豆，筛选出纯合突变体甲，将其与野生型大豆为亲本，进行正反交获得 F ，采用特异性引物对双亲及 F 植株的基因组进行 PCR 扩增，结果如下图。下列分析错误的是（ ）
A．γ射线照射可提高大豆基因突变频率B．杂交成功获得的 F 植株有 3、4、7、9C．突变体甲自交获得的 F 植株有 3 种D．获得的 F 植株自交，后代基因型频率不变
　实战训练　
8．用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是（　　）
A．用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段得到6个游离的磷酸基团B．图1中X代表的碱基对数为4500，Y是限制酶A的酶切位点C．电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关D．设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR
　实战训练　
9．DNA测序时，先将待测单链DNA模板、引物、有关酶、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP，N代表A、T、C、G，能提供能量并作为DNA复制的原料）均加入4个试管中，再分别加入一定量的含放射性同位素标记的ddNTP（ddGTP、ddATP、ddCTP、ddTTP）。不同于dNTP的是，ddNTP的五碳糖的3位不含羟基。在DNA合成时ddNTP随机与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA的延伸，从而形成不同长度的一系列终止处带有放射性同位素标记的DNA链。下图是DNA测序时得到含放射性标记的子代DNA的电泳图谱。下列相关说法错误的是（　　）
A．反应体系中的引物为单链，DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸B．ddNTP终止子链延伸，其原理可能是其五碳糖的3'位不含羟基，无法连接新的脱氧核苷酸C．图中加入ddCTP的一组中，可以形成3种长度的子链D．图中子代DNA的碱基序列是5'-GATCCGAAT-3'
　实战训练　
10．脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种单基因遗传病，主要由运动神经元存活基因 1（SMN1）突变引起，SMA 在胎儿发育期常常不表现出结构畸形，出生后表现为肌无力和肌萎缩，具有严重的致死性。现有一对正常夫妻，生出一个 SMA 男孩（染色体组成为 XXY）后他们进行了基因检测，电泳结果如图（正常基因一条带，致病基因为另一不同的条带，不考虑 XY同源区段）。下列叙述正确的是（ ）
A．患病男孩同时患有常染色体隐性遗传病和染色体异常遗传病B．SMA的致病原因是SMN1 基因碱基的缺失引起的基因突变C．患病男孩的染色体异常是由于母亲或父亲减数分裂Ⅰ性染色体未分离导致的D．SMA 遗传病可以通过 B超检查等产前诊断进行治疗
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11．苯丙酮尿症是常染色体单基因遗传病。图1是某患者的家族系谱图，其中部分成员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1和Ⅱ2的DNA经限制酶MspI酶切，产生不同的片段，经电泳后用苯丙氨酸羟化酶cDNA探针杂交，结果见图2。下列分析错误的是（ ）
A．个体Ⅱ2与一杂合个体婚配生患病孩子的概率为0B．个体Ⅱ3是隐性纯合体，只有19kb探针杂交条带C．个体Ⅱ4可能为纯合体且有1个探针杂交条带D．个体Ⅰ1、Ⅰ2再生出一个孩子和个体Ⅱ4基因型相同的概率是3/4
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12．以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是（ ）
A．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的B．基因表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNAC．基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等D．基因表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
　实战训练　
13．在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是（ ）
A．引物1与引物2 B．引物3与引物4C．引物2与引物3 D．引物1与引物4
　实战训练　
14．用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（　　）
A．PCR产物的分子大小在250至500 bp之间B．3号样品为不含目的基因的载体DNAC．9号样品对应植株不是所需的转基因植株D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
　实战训练　
15．PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是（ ）
A．图示环节所需的温度比上一个环节的低B．引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列C．耐高温Taq酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链D．1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同

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