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(共52张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
培育转基因抗虫棉的简要过程
苏云金杆菌
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
抗虫基因
（Bt抗虫蛋白基因）
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
具体的步骤？
(含抗虫基因）
（含有并表达抗虫基因）
第一步：目的基因的筛选与获取
（一）目的基因
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
如何筛选目的基因？
Bt基因的筛选过程：
（二）筛选合适的目的基因
1.较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2.技术手段：
第一步：目的基因的筛选与获取
测序技术
序列数据库(如GenBank)
序列比对工具(如BLAST)
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
1、人工合成
我国首批转基因抗虫棉的培育使用
第一步：目的基因的筛选与获取
（三）目的基因的获取
序列已知，基因比较小 → DNA合成仪
常用方法
聚合酶链式反应
根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
2、利用PCR获取和扩增目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取
(1)PCR:
体内DNA复制的过程
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物(通常为小的单链RNA)
体内DNA复制的过程
PCR的过程
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物(通常为小的单链RNA)
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物(通常为小的单链DNA)
反应还需要其它条件，如缓冲液（添加Mg2+等）
PCR的过程
第一步：目的基因的筛选与获取
(2)PCR反应的条件：
① 模板：
② 原料：
③ 引物：
④ 酶：
⑤ 缓冲液（含Mg2+）：
⑥ 不同温度
第一步：目的基因的筛选与获取
(3) 引物：
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。
为什么要有引物？
引物为DNA聚合酶提供了游离的3'端，使DNA聚合酶从3'端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
① 作用：
如何设计引物？
设计引物
已知：Cry1Ab基因全序列 702bp
5’ 1 aaatgtgccc atcattccca tcatttctcc ttggacattg atgttggatg tacagactta
61 aatgaggact taggtgtatg ggcgatattc aagattaaga cgcaagatgg ccatgcaaga
121 ctaggaaatc tagagtttct cgaagagaaa ccattagtag gggaagcact agctcgtgtg
181 aaaagagcgg agaaaaaatg gagagacaaa cgtgaaaaat tggaattgga aacaaatatt
241 gtttataaag aggcaaaaga atctgtagat gctttatttg taaactctca atatgataga
301 ttacaagcgg ataccaacat cgcgatgatt catgcggcag ataaacgcgt tcatagcatt
361 cgagaagcat atcttccaga gttatctata attccgggtg taaatgcggg cattttcgaa
421 gaattagagg gacgtattta cacagcctac tctctatatg gtgcgagaaa tgtcattaaa
481 aatggcgatt tcgataatgg cttattatgc tggaacgtga aagggcatgt agatgtagaa
541 gaacaaaaca atcaccgttc agttctggtt atcccagaat gggaagcaga agtgtcacaa
601 gaagttcgtg tctgtccagg acgtggctat atccttcgtg ttacagcgta caaagaggga
661 tatggagagg gcttcgtaac gatccatgag atcgaagaca at 3’
设计引物
1.设计几种引物？原因？
2.设计引物的依据？
3.引物的选择？
4.请同学们设计引物的核苷酸序列
5＇
3＇
3＇
5＇
A
B
C
D
已知：Cry1Ab基因全序列 702bp
5’1 aaatgtgccc atcattccca tcatttctcc ttggacattg atgttggatg tacagactta
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任务三
设计引物
5. 某同学设计的两组引物（只标记了部分碱基序列）如下，请评价引物设计是否合理？若不合理，请分析说明理由。
第1组引物
引物Ⅰ
引物Ⅱ
C A G G C T
A G C C T G
第2组引物
引物Ⅰ
引物Ⅱ
A A C T G ···· C A G T T
C G A C T ···· G A T T A
5＇
3＇
5＇
3＇
3＇
3＇
5＇
5＇
第一步：目的基因的筛选与获取
② 设计引物：
依据：
目的基因两端特异性较高的核苷酸序列
种类：
2种；确保DNA的两条链同时被扩增
要求：
长度不宜过短；引物之间和引物内部不发生碱基互补配对等
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
第一步：目的基因的筛选与获取
(4) 过程：
第二轮循环的产物
第三轮的产物
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
第一轮循环的产物
3’
5’
3’
5’
【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
扩增次数 1次 2次 3次 n次
DNA分子数
同时含引物A、B的DNA分子数
共消耗的 引物数量
完整的目的基因
PCR扩增DNA规律
扩增次数 1次 2次 3次 n次
DNA分子数
同时含引物A、B的DNA分子数
共消耗的 引物数量
完整的目的基因
2
2
0
4
6
8
14
2
6
2n
2n+1-2
2n-2
PCR扩增DNA规律
0
0
2
2n-2n
第一步：目的基因的筛选与获取
(5) PCR扩增产物的鉴定
——琼脂糖凝胶电泳
在电场作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳
② 影响DNA迁移速率的因素：
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。
① 原理：
③ 检测：
凝胶中的DNA分子通过染色，在300nm的紫外灯下被检测出来。
第一步：目的基因的筛选与获取
(5) PCR扩增产物的鉴定
——琼脂糖凝胶电泳
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
核酸酶H：降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
（2）基因文库的种类：
基因组文库：
部分基因文库：
含有一种生物所有基因的文库
只含有一种生物部分基因的文库
（如：cDNA文库）
第一步：目的基因的筛选与获取
3、从基因文库中获取
（1）基因文库：
提取某种生物的全部DNA
许多一定大小的DNA片段
导入受体菌中储存
用适当的限制酶切
将DNA片段与载体连接
基因组文库
①基因组文库的构建模式图
第一步：目的基因的筛选与获取
某种生物的mRNA
单链互补DNA
双链DNA片段
反（逆）转录酶
DNA 聚合酶
cDNA文库
成熟mRNA
与载体连接导入受体菌中储存
②部分基因文库的构建模式图
第一步：目的基因的筛选与获取
思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？
如果不能，如何避免该结果的发生呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。
构建基因表达载体（核心工作）
1. 目的：
2. 组成：
① 使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
② 使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
第二步：基因表达载体的构建（核心）
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
供目的基因插入载体中
第二步：基因表达载体的构建（核心）
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
第二步：基因表达载体的构建（核心）
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
便于重组DNA的筛选
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
第二步：基因表达载体的构建（核心）
黏性末端
（平末端）的切口
质粒（载体）
DNA分子（含目的基因）
相同黏性末端
（平末端）的切口
DNA 连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同种限制酶
（或产生相同末端的限制酶）
3. 过程：
第二步：基因表达载体的构建（核心）
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。
拓展：限制酶的选择方法
将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？
如果这么做，效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞
由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。
第三步：将目的基因导入受体细胞
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
基因表达载体
受体细胞
导入
动物
植物
微生物
第三步：将目的基因导入受体细胞
（一）将目的基因导入植物细胞
1、花粉管通道法
——我国独创，将Bt基因导入棉花细胞。
用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
① 子房注射：
② 花柱滴加：
萌发的花粉管
花柱
子房
胚囊
柱头
卵细胞
2、农杆菌转化法
双子叶植物和裸子植物
Ti质粒
T-DNA
农杆菌
第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）主要适用于：
（2）特点：
农杆菌Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。
转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
Ti质粒
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
导入植物细胞
表现出新性状的植物
将目的基因插入染色体DNA中
第三步：将目的基因导入受体细胞
（3）过程：
①两次拼接
第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
②两次导入
第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1、常用方法：
2、受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
3、过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
第三步：将目的基因导入受体细胞
（二）将目的基因导入动物细胞
Ca2+处理
使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态（感受态）
Ca2+处理细胞
重组基因表达载体导入细胞
Ca2+
吸收
原核细胞（常选择大肠杆菌）
第三步：将目的基因导入受体细胞
（三）将目的基因导入微生物细胞
1、常用菌：
2、转化方法:
3、过程：
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
不一定！
第四步：目的基因的检测与鉴定
在抗虫棉的培育过程中，目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
PCR等技术检测
抗原 — 抗体杂交技术
分子
水平
抗虫鉴定
（个体水平）
第四步：目的基因的检测与鉴定
（一）分子水平的检测
1、检测目的基因是否导入
——PCR技术检测
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
DNA半保留复制
根据目的基因特点，设计特定引物 → 是否扩增出目的基因（电泳检测）
方法二：
DNA分子交杂技术
变性
① 提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针；
② 使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，则导入成功。
原理：碱基互补配对原则
第四步：目的基因的检测与鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
2、检测目的基因是否转录
——PCR技术检测
提取受体细胞mRNA
提取棉花细胞mRNA
逆转录
产生DNA
对扩增产物进行检测
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
逆转录
cDNA
PCR扩增
①制作基因探针；
②探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了mRNA。
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
杂交分子
（可检测）
原理：碱基互补配对原则
分子杂交
方法二：
第四步：目的基因的检测与鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
3、检测目的基因是否翻译：
抗原-抗体杂交
从棉花中
提取蛋白质
用相应抗体进行
抗原-抗体杂交检测
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
抗原
抗体
杂交
脱分化
第四步：目的基因的检测与鉴定
（二）个体水平的鉴定
如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状
观察棉铃虫
存活情况
饲喂
棉铃虫
采摘抗虫棉叶片
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
第四步：目的基因的检测与鉴定
（二）个体水平的鉴定

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