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第2节 微生物的培养技术及应用
一 生物的基本培养技术
第1章 发酵工程
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
从社会中来
实验室培养微生物的条件:
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
——培养基
——无菌技术
一、要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；
二、要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
微生物：
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
微生物的类群
病毒
SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌（大肠杆菌、乳酸菌、根瘤菌、硝化细菌）、蓝细菌、
放线菌、支原体、衣原体等
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
相关信息（P9）
一、培养基的配制
2.培养基的作用：
1. 培养基的概念
培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
固体
培养基
液体
培养基
有无琼脂
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养、用于工业生产
凝固剂
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3.培养基的分类：
琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，不能为微生物生长提供能量和碳源。
微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落
菌落：是指由单个微生物细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞集团。
念珠菌
霉菌
酵母菌
放线菌
形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。
菌落是鉴定菌种的重要依据
培养基的类型及用途
标准 培养基种类 培养基特点 作用
物理性质 固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，
活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂。容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、
分类鉴定
液体培养基 不加凝固剂 常用于扩大培养，工业生产
功能 选择培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长 培养、分离出特定微生物
鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物 鉴别不同种类微生物
成分来源 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确 分类鉴定
选择培养基
鉴别培养基
4.培养基的营养构成：
各种培养基的配方不同，但一般都含有水、 无机盐、碳源和氮源等营养物质。
①概念：
（1）碳源
②种类：
凡是能提供碳元素的物质，统称为碳源
无机碳源
有机碳源
CO2、CO32-、HCO3-等含碳无机物
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等含碳有机物，常用：糖类，尤其是葡萄糖。
③功能：
主要用于构成细胞物质和一些代谢产物；
有机碳既是碳源又是异养微生物的能源物质。
自养微生物
异养微生物
【说明】含有C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。
①概念：
（2）氮源
②种类：
③功能：
凡是能提供氮元素的物质，统称为氮源
无机氮源
有机氮源
主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等
NH4＋、NO3-、NH3等
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
牛肉膏和蛋白胨来源于动物含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
一般情况下，不添加氮源培养基可用来培养固氮微生物
（3）水
（4）无机盐
①良好的溶剂；
②维持生物大分子结构的稳定。
①提供无机营养；
②调节pH；
③维持渗透压。
分析牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
几种微生物的营养和能量来源分析
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 NH4＋、NO3-等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
1.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于 ；
自养型微生物所需的碳源来自 碳源，
异养型微生物所需的碳源来自 碳源
2.无机氮源不但能给自养型微生物提供 ，也能作为 ，
3.含有C、H、O、N的有机物可作为 微生物的碳源、氮源、能源；
碳源
无机
有机
氮源
能源物质
异养型
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对___、____________ 以及___的需求；
pH
特殊营养物质
O2
微生物例子 培养基需要的特殊物质或条件
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
添加维生素
调至酸性
调至中性或弱碱性
提供无氧的条件
5.培养基的特殊需求
具体处理 原理 目的
选择培养基 加入青霉素 青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用
不加氮源 固氮微生物能利用空气中的氮气
不加有机碳源 自养型微生物能利用无机碳源
鉴别培养基 加入酚红培养基 尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。
加入刚果红 刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养微生物
鉴别分解尿素的细菌
鉴别纤维素分解菌 P20
二、无菌技术
无菌技术的具体内容
（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和 。
（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行 。
（3）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 接触。
（4）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 并在 附近进行。
消毒
灭菌
周围的物品
酒精灯火焰
超净工作台上
获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌污染。
1.概念：
指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
2.常用的消毒方法：
（1）煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
（2）巴氏消毒法：62～65℃下消毒30 min或80～90℃处理30s～1min，适合一些不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。
（3）化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
（4）紫外线消毒法：接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线照射30min。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
消毒
常用的消毒和灭菌方法
消 毒
化学药剂
紫外线
02
生物消毒法:指利用微生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
芽孢：
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体
孢子：
某些生物的繁殖体细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。
例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
灭菌
1.概念：
常用的消毒和灭菌方法
根霉
湿热灭菌
实验室常用高压蒸汽灭菌锅，在压力100kPa、温度121 ℃条件下，维持15-30min
利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌
原理：
对象：
优点：
高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
培养基及多种器材和物品等
使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
【强调】
灭菌
高压蒸汽灭菌锅
干热灭菌箱内，在160-170 ℃的热空气中维持下2-3h达到灭菌目的
干热灭菌
原理：
使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
对象：
耐高温，需保持干燥的物品
玻璃器皿 （如试管、培养皿、吸管、注射器）
金属器具 （如针头、 镊子、剪刀等）
干热灭菌箱
灭菌
灼烧灭菌
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
效果：
原理：
对象：
最彻底
使微生物燃烧
接种工具如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，
接种过程中的试管口或瓶口等容易被污染的部位
灭菌
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
培养基的类型
培养基的营养物质
消毒
灭菌
微生物的实验室培养
【课堂小结】
培养基
无菌技术
按物理性质划分
按组成成分划分
按功能划分
基本成分：碳源、氮源、水、无机盐
特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等
煮沸消毒
巴氏消毒
紫外线消毒
化学药剂消毒
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
消毒和灭菌的比较及无菌技术的其他作用
1.牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是什么？
在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
2.为什么体积分数为70%～75%的酒精杀菌效果最好？
若酒精浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；若酒精浓度过低，杀菌能力减弱。
3.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
目的：①防止培养物被污染；②防止感染实验操作者。
巩固练习
一下物品所采用的灭菌或消毒方法依次是
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
灼烧灭菌
化学药剂消毒（酒精）
紫外线消毒
巴氏消毒法
三、微生物的纯培养
培养物：
纯培养：
纯培养物：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的培养。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
1.相关概念
2.微生物纯培养的步骤
配制培养基
灭菌
接种
分离
培养等
酵母菌的纯培养
1.实验原理：
微生物群分散或稀释成单个细胞，单个细胞繁殖成单个菌落。
①菌落
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
②纯培养的方法：
一个菌落就是一个种群。
探究 实践
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
区别不同菌落的依据大小、形状、颜色、光泽度、透明度等。
（1）配制培养基
配制培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
四、方法步骤
（2）灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa 、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。
将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃ 灭菌2h。
四、方法步骤
待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作步骤如下：
①拔出锥形瓶的棉塞。
②将瓶口迅速通过火焰。
③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
仔细看图：在倒平板的过程中，为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
（3）倒平板
四、方法步骤
琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板时，高于50 ℃则会烫手，若低于50℃不及时操作，琼脂会凝固。
3.为什么倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能完全打开？
防止杂菌污染培养基
实验注意事项、分析、思考
1.培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？
2.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
4.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？
避免杂菌污染
5.倒平板时为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
6.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
7.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
8.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
接种：指在无菌条件下将微生物或含菌材料转移到合适其生长繁殖的培养基中的过程。
接种工具：
接种针——用于穿刺接种；
接种环——用于斜面接种或平板划线接种；
涂布器——用于涂布平板接种；
（4）接种和分离
接种的方法：稀释涂布平板法、穿刺接种法、斜面接种法、平板划线法
平板划线法
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
连续划线法
分区划线法
微生物的纯培养
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞
③将试管口通过火焰
④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次划线相连。
平板划线法的操作步骤：
微生物的纯培养
第1次划线
灼烧接种环灭菌
第2次划线
灼烧接种环灭菌
第3次划线
灼烧接种环灭菌
灼烧接种环灭菌
1
2
3
4
5
【平板划线法注意事项】
①接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；
③每次划线前灼烧接种环进行灭菌；在5个区域划线，接种环灼烧灭菌共6次。
④划线操作结束后，仍需灼烧接种环，
培养皿倒置培养。
分区划线法
培养：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 24 ~ 48h。
微生物的纯培养
（5）培养酵母菌
警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
1.在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被
杂菌污染。
2.提示 如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
微生物的纯培养
5.结果分析与评价
1.为什么在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。
杀死接种环上原有微生物
6.实验注意事项、分析、思考
2.在灼烧接种环之后，要等其冷却再进行划线，目的是什么？
避免温度过高杀死菌种
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
①一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
②存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落
4.为什么划线时要注意不能划破培养基？
3.除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？
5.未接种的培养基直接培养起什么作用？
做空白对照，若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。
思维训练
评估论点的可信程度
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水，密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
课堂小结
微生物的基本培养技术
无菌技术
煮沸消毒法
纯培养
培养基
固体培养基
接种分离
平板划线法
稀释涂布平板法
种类
液体培养基
营养
水、碳源、氮源、无机盐
消毒
巴氏消毒法
灭菌
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用
一、概念检测
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
练习与应用
一、概念检测
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看,洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
提示（1）：培养皿和培养基。
提示（2）：接种。
（3）提示：通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
二、拓展应用
练习与应用
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同,意味着培养条件有什么不同？
提示：意味着培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
提示：培养液中02含量越高,酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
提示：这时候已经达到了环境容纳量。
二、拓展应用
练习与应用

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