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第2节 动物细胞培养
第2章 细胞工程
动物细胞工程常用的技术：
动物细胞培养
动物细胞融合
动物细胞核移植等
动物细胞工程的基础
一 动物细胞培养
动物细胞培养需要哪些基本条件？
动物细胞培养的基本操作过程是什么？
本节聚焦
1
2
3
怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？
从社会中来
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
通过细胞培养构建的人造皮肤
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；
人造皮肤：人体再生术的秘密
1.概念
从动物体中____相关的____，将它_____________，然后在_____________下，让这些细胞_____和_____的技术；
取出
组织
分散成单个细胞
适宜的培养条件
生长
增殖
动物细胞培养
动物细胞融合
动物细胞核移植
动物细胞工程
基础
动物细胞培养
从动物体中取出相关的组织
将它分散成单个细胞
在适宜的培养条件下
细胞生长和增殖
原理：
细胞增殖（有丝分裂）
植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术（对比）
01
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的条件
营养条件
其他条件
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等
一、动物细胞培养的条件
血清中不仅含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营养物质，还有激素及多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。
（1）成分
①已知成分
将细胞所需的________（糖类、氨基酸、无机盐、维生素等）按其_____和_______严格配制而成的培养基，称为___________
②未知成分
使用合成培养基时，通常需加入____等一些天然成分
原因：_ ______________________________________
（2）培养基的物理性质
培养动物细胞一般使用_________，也称为______
营养物质
种类
所需量
合成培养基
血清
血清中含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质
液体培养基
培养液
一、动物细胞培养的条件
1.营养
不包括淀粉、蔗糖等
①对______和____________进行_____处理；
②在________下进行操作；
③还需要______________。
培养液
所有培养用具
灭菌
无菌环境
定期更换培养液
在细胞培养液中添加一定量的抗生素
一、动物细胞培养的条件
2.无菌、无毒的环境
目的：以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
如何防止培养过程中的微生物污染？
思考？
①适宜的温度
哺乳动物细胞培养的温度多以 ___________为宜；
②适宜的pH
多数动物细胞生存的适宜pH为________
③适宜的渗透压
维持适宜渗透压的目的______________________
36.5±0.5℃
7.2-7.4
维持细胞正常的形态和功能
一、动物细胞培养的条件
3.温度、pH和渗透压
（1）组成
动物细胞培养所需气体主要有___和____
（2）不同气体的作用
①O2：_____________________
②CO2：_________________________
（3）培养容器
通常采用_______或____________
（4）培养仪器
含有 ___和___ _的混合气体的__________
O2
CO2
O2是细胞代谢所必需的
CO2的主要作用维持培养液的pH
培养皿
松盖培养瓶
95%空气
5%CO2
CO2培养箱
一、动物细胞培养的条件
4.气体环境
02
动物细胞培养的过程
二
动物细胞培养的过程
阅读教材P44-45,思考并回答下列问题：
_________________________________________________________________________________________________________________________
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
分瓶
进行传代培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
传代培养
放入CO2培养箱中培养
细胞贴壁
接触抑制
二、动物细胞培养的过程
①原代培养
通常将________的细胞培养，即动物组织经_____后的________称为原代培养；
②传代培养 将______的细胞培养称为传代培养；
③细胞贴壁 ______体外培养的细胞需要______________ ___才能生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的____上，这种现象称为细胞贴壁；
分瓶之前
处理
初次培养
分瓶后
大多数
贴附于某些基质表面
瓶壁
重要名词解释
二、动物细胞培养的过程
二、动物细胞培养的过程
④接触抑制
当_____细胞生长到__________ _时，细胞通常会____________；
重要名词解释
贴壁
表面相互接触
停止分裂增殖
接触抑制
打破接触抑制的方法：将贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。
1.取动物组织
（1）取材:
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
（2）取材原因:
细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
2.制成细胞悬液
（1）将组织分散成单个细胞
①方法:
机械法
用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
②原因:
Ⅰ.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；
Ⅱ.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。
二、动物细胞培养的过程
用胰蛋白酶分散细胞,说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白晦就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。
3.原代培养
（1）操作方法：
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
（2）体外培养的动物细胞类型
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
除受密度、有害代谢物、营养物质影响外，还会发生接触抑制现象。
二、动物细胞培养的过程
②贴壁生长类：
4.分瓶、进行传代培养
（1）需分瓶进行传代培养的原因：
悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质等因素而分裂受阻，贴壁细胞在生长增殖时，除受上述因素影响外，还会发生接触抑制现象
（2）方法：
①收集细胞
a.悬浮生长类：
直接用离心法收集
b.贴壁生长类：
重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集
②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
二、动物细胞培养的过程
正常细胞能否一直传代培养下去？
思考
传代培养
部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止
大部分细胞衰老死亡
少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展
10~50代
继续培养
（50代以后）
（有限细胞系）
（无限细胞系）
使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)。
这一阶段的细胞称为细胞株
无限细胞系的遗传物质发生改变
取动物组织
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
分散成单个细胞
解决
悬浮生长
贴壁生长
(大多数）
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
传代培养
细胞悬液
原代培养
分瓶
培养
加培养液
在培养皿或培养瓶内
悬浮培养的细胞:直接用离心法收集
贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集
细胞分裂受阻
②制成细胞悬液，分瓶培养
①收集细胞
动物细胞培养的过程归纳：
思考？
1.为什么要对取出的动物组织进行处理，
使细胞分散？
2.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？
胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消 化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。
Ⅰ.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；
Ⅱ.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
思考？
4.离心的作用？
5.动物细胞培养技术有没有体现动物细胞的全能性？
在沉淀中得到细胞，同时去掉上清液中的胰蛋白酶
未体现；动物细胞培养只是细胞增殖的过程
思考？
6.“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因
癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少
有关动物细胞培养的问题
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。
2.动物细胞培养和植物组织培养有什么相同和不同之处？
植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养前处理
取材
培养基的物理性质
培养基的成分
特有成分
植物细胞的全能性
细胞增殖
离体
用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开
离体植物器官、组织、细胞
动物胚胎或幼龄动物的组织、器官
固体
液体(又称培养液)
有机营养成分
无机营养成分
植物激素
糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清
植物激素
血清
动物细胞培养和植物组织培养的比较
植物组织培养动物细胞培养特殊环境条件结果是否体现细胞的全能性过程相同点再分化需光气体环境一般获得新的植株获得大量细胞是否①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。外植体脱分化愈伤组织再分化根、芽幼苗完整植株移栽成活取动物组织制成细胞悬液转入培养液进行原代培养分瓶进行传代培养动物细胞培养和植物组织培养的比较1.分布
干细胞存在于________、______和_______等多种组织和器官中；
2.分类
干细胞包括 __________和__________等
（1）胚胎干细胞（简称ES细胞）
①分布：存在于________中
②特点
③应用实例
早期胚胎
骨髓
脐带血
胚胎干细胞
成体干细胞
早期胚胎
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能
ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等
三、干细胞培养及其应用
（2）成体干细胞
①分布：存在于_ _______________中
②常见类别：包括_____中的 、________中的 、____中的__________等；
③特点
④发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例
成体组织或器官内
骨髓
造血干细胞
神经系统
神经干细胞
睾丸
精原干细胞
一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
造血干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中
三、干细胞培养及其应用
三、干细胞培养及其应用
有着______ _能力及____潜能的干细胞，与________的_______________等密切相关；
4.干细胞应用面临的问题存在________________
自我更新
分化
组织、器官
发育、再生和修复
类型 应用
造血干细胞
神经干细胞
诱导多能干细胞（iPS细胞）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
导致肿瘤发生的风险
三、干细胞培养及其应用
3.干细胞的应用
干细胞可以治疗某些顽症的原理是什么？
干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，
经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能
但是，胚胎干细胞存在局限性：胚胎干细胞必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。
情景思考
（1）诱导多能干细胞概念
三、干细胞培养及其应用
通过体外诱导成纤维细胞，获得类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞。
（2）制备iPS细胞的方法
①借助载体将特定基因导入细胞中诱导形成iPS细胞
②直接将特定蛋白导入受体细胞中诱导形成iPS细胞
③用小分子化合物来诱导形成iPS细胞诱导形成iPS细胞
4.诱导iPS细胞及其应用
（3）iPS细胞的来源
三、干细胞培养及其应用
4.诱导iPS细胞及其应用
（4）iPS细胞的优点
成纤维细胞以及已分化的T细胞、B细胞
①诱导过程无需破坏胚胎
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应；
*因此，普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞
(5)应用
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
三、干细胞培养及其应用
4.诱导iPS细胞及其应用
可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
概述
培养条件
过程
动物细胞培养
原理
取材
地位
原代培养
营养条件
温度、pH和渗透压
无菌、无毒的环境
气体环境
制成细胞悬液
传代培养
干细胞
分布
分类
应用
课
堂
总
结
练习与应用
一、概念检测
1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
(1)培养环境中需要O ，不需要CO 。 ( )
(2)细胞要经过脱分化形成愈伤组织。 ( )
(3)培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。 ( )
(4)培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。 ( )
×
√
×
×
练习与应用
一、概念检测
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是 ( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B、造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
A
二、拓展应用
练习与应用
现在关于iPS细胞的研究正在不断深人。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。
(1)由于诱导产生iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
建立iPS细胞库（HLA多态性丰富的iPS细胞库），
可以为需要的人找到HLA匹配度较高的iPS细胞
二、拓展应用
练习与应用
(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用 又可能带来哪些问题
可以用来治疗不孕症；可以用来进行濒危物种的克隆；
可以对获得的生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物；
可能会带来一系列的伦理问题，例如用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿，有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而”设计”婴儿

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