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(共33张PPT)
2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体
19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
肺结核病人病理切片
旁栏思考P49
一、动物细胞融合技术
1.概念：
2.结果：
3.原理：
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜具有
一定的流动性
形成 ，具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
杂交细胞
一、动物细胞融合技术
4.动物细胞融合的诱导方法：
5.意义：
6.应用：
物理法：
化学法：
生物法：
灭活病毒诱导法
电融合法、离心法
聚乙二醇（PEG）融合法
动物细胞融合特有
与植物原生质体融合的方法相同
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。
①研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育新品种等；
②发展“杂交瘤技术”，制造“单克隆抗体”。
【思考】诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？为什么？
不一定。
诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。
1965年，研究证实了灭活的病毒在适当条件下确实可以诱导动物细胞融合。
相关信息P48：灭活病毒诱导法
HIV侵染过程图
相关信息P48：灭活病毒诱导法
吸附 注入 合成 组装 释放
外壳
包膜
核酸
逆转录酶
表面蛋白
病原体：人类免疫缺陷病毒（HIV）：
相关信息P48：灭活病毒诱导法
1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？
病毒
物理或化学手段
失去感染性（不感染细胞）
保留抗原性（诱导细胞融合）
2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？
相关信息P48：灭活病毒诱导法
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
动物细胞融合完成的标志：
细胞核的融合
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
融合前处理
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜的流动性、
植物细胞的全能性
细胞膜的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
①机械法；②用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
物理法：电融合法、离心法；
化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、
灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
形成杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种
突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
二、单克隆抗体及其应用
抗原不纯
抗体不纯
缺陷：产量低、纯度低，特异性差
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
1.早期获得抗体的方法
抗原
免疫过程
传统抗体
多种混合
①怎样才能得到纯的抗体？
②光纯还不行，还要大量，怎么办？
③B细胞不能无限增殖，怎么办？什么细胞能无限增殖呢？
想要获得单一的纯抗体，就必须从一个B细胞出发。
让B细胞大量繁殖（克隆）就可以产生大量抗体了。
二、单克隆抗体及其应用
2.一个大胆的设想
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
（能产生抗体）
（能大量增殖）
融合细胞（杂交瘤细胞）
二、单克隆抗体及其应用
2.一个大胆的设想
英国米尔斯坦
德国科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
观察图2-16，思考以下问题：
①给小鼠注射特定抗原的目的是什么？哪里收集B细胞？
②从小鼠体内提取的B淋巴细胞只有一种吗？为什么？
③诱导融合后有多少类杂交细胞？
④两次筛选的目的和手段分别是什么？
⑤获得大量单克隆抗体的方法有哪些？
二、单克隆抗体及其应用
3.过程
3.过程：
注射特定的抗原
培养骨髓瘤细胞
从脾中提取
B淋巴细胞
多种
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
①不产生抗体的B细胞
②产生A1、A2、A3...等不同抗体的B细胞
目的：得到能产生特定抗体的B淋巴细胞
融合体系中有多少种类型的细胞？
未融合的细胞
B淋巴细胞相互融合的细胞
骨髓瘤细胞相互融合的细胞
杂交瘤细胞
√
筛选
未融合的细胞
B淋巴细胞相互融合的细胞
骨髓瘤细胞相互融合的细胞
杂交瘤细胞
资料分析：
a.细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。
b.免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。
c.鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死。
请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法：
培养基中加入氨基蝶呤
√
多种杂交细胞
未融合的细胞
骨-骨、
B-B、
第一次筛选：
用特定的选择培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
第二次筛选：
克隆化培养、抗体检测
（多次筛选）
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞（每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞）
克隆化培养
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
分泌的抗体能与特定抗原结合
3.过程：
多孔细胞培养板
阳性克隆的筛选和克隆化培养
用培养液有限稀释
克隆化培养
抗体检测
单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
原因
目的 筛选出_____________ 筛选出__________________
的杂交瘤细胞
方法 用 筛选： 未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种 的情况下进行 和 。
诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等
杂交瘤细胞
特定的选择培养基
死亡
生长
小鼠还受到其他抗原的刺激，经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
能分泌所需抗体
一个杂交瘤细胞
克隆化培养
抗体检测
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
3.过程：
向小鼠注射特定的抗原
培养小鼠
骨髓瘤细胞
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
多种细胞
多种杂交瘤细胞
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
第一次筛选：选择培养基
第二次筛选：克隆化培养 + 专一抗体检测
注射到小鼠腹腔内增殖
体外培养
单克隆抗体
融合
3.过程：
应用到的技术：
原理：
动物细胞融合、动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
与特定抗原发生特异性结合
（特异性强）
能准确地识别抗原的细微差异（灵敏度高）
可以大量制备
二、单克隆抗体及其应用
4.特点/优点
孕妇血液中提取HCG
↓
作为“特定的抗原”
↓
制备抗HCG的单克隆抗体
思考·讨论：单克隆抗体的应用
资料1：妊娠早期孕妇产生的一种物质“人绒毛膜促性腺激素（HCG），如何检测？
二、单克隆抗体及其应用
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
血型检测试剂
新冠病毒抗原检测试剂盒
5.应用
①作为诊断试剂
（多种疾病的诊断和
病原体鉴定等）
——最广泛应用
“单抗药”：药物 + 单克隆抗体，如ADC（抗体—药物偶联物）。其中单克隆抗体的作用是特异性识别并结合病理细胞。因此其制备过程中的第一步是……
2015年，我国的单抗药市场规模达72亿！
思考·讨论：单克隆抗体的应用
资料2：
提取只在病理细胞表达的受体蛋白
↓
作为“特定的抗原”
↓
制备单克隆抗体
ADC=
单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）
②用于治疗疾病和运载药物
二、单克隆抗体及其应用
5.应用：
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；
药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；
②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
①特异性强、灵敏度高、可以大量制备；
②药物ADC具有靶点清楚、疗效高、毒副作用小等优点。
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
C
A
二、拓展应用
假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。
但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。
现学现用
1.将特定药物与单克隆抗体相结合制成的“生物导弹”，能够用于杀死人类某些癌细胞。其过程如图所示。下列有关叙述错误的是（　　）
A. ①过程的原理和植物原生质体融合的原理基本相同
B. 经①形成的杂交瘤细胞都能无限增殖并产生特定抗体
C. ②过程需要筛选并克隆单个杂交瘤细胞
D. 抗体的靶向作用使③过程具有高度特异性
B
现学现用
2.神经纤毛蛋白-1（NRP-1）是一种多功能糖蛋白，在多种肿瘤组织中呈高表达，可与血管内皮生长因子结合促进肿瘤血管的形成，使肿瘤体积增大。科研人员通过制备NRP-1单克隆抗体，开展对小鼠的乳腺癌组织进行靶向治疗的研究。请分析回答：
（1）制备单克隆抗体涉及的动物细胞工程常用技术有
_________________________________________（写出两项）。
（2）制备时，首先给小鼠注射_________________________，分离得到B淋巴细胞。将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合后得到杂交瘤细胞，经抗体检测筛选出___________________________细胞注射到小鼠腹腔中，从腹水中提取大量的NRP-1单克隆抗体。
动物细胞培养、动物细胞融合
NRP-1（或神经纤毛蛋白-1）
能产生NRP-1抗体的杂交瘤
2.（3）为了论证制备的单克隆抗体的治疗效果，研究者选择生长状况一致的小鼠，分别注射等量的乳腺癌细胞悬液，经饲养后，各小鼠均形成了体积基本相同的肿瘤。
①将上述小鼠随机分成实验组和对照组，实验组和对照组分别注射_____________________、_______________，且每隔3天重复进行相同的注射操作，一段时间后发现，实验组小鼠的肿瘤体积都小于对照组，原因可能是NRP-1单克隆抗体与NRP-1发生特异性结合，阻断了_____________________________的结合，从而抑制了肿瘤血管生成。
②上述实验小鼠应选用没有________（填器官）的动物模型鼠，由于这种鼠存在免疫缺陷，实验时可以避免小鼠的免疫系统对乳腺癌细胞进行攻击，从而保证实验结果更可靠。
NRP-1单克隆抗体溶液
等量的生理盐水
血管内皮生长因子与NRP-1
胸腺

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