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高中生物一轮复习
第40课 基因工程（1）
思维导图
1.DNA基本结构
磷酸
脱氧核糖
含氮碱基
A(腺嘌呤)
G(鸟嘌呤)
C(胞嘧啶 )
T(胸腺嘧啶)
1’
2’
3’
4’
含Ｎ碱基
脱氧
核糖
磷酸
5’
模型建构1:
组成DNA的基本单位是脱氧核苷酸，其化学组成包括磷酸、碱基和脱氧核糖
2.DNA双螺旋结构的主要特点
G
A
G
G
C
C
C
T
A
T
C
C
T
G
G
A
G
O
CH2
OH
H
碱基
3′
2′
H
H
1′
4′
5′
H
H
磷酸基团
5'
3'
5'
3'
DNA的一条单链具有两个末端，一端有一个游离的磷酸基团，称作5'－端，另一端有一个羟基(—OH)，称作3'－端，两条单链走向相反
DNA的两条单链按反向平行方式盘旋成双螺旋结构。
DNA中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。
两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对：A与T配对(3个)；G与C配对（2个）。
基因工程
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
操作对象及环境
操作水平
操作原理
结果
生物体外
基因
DNA分子水平
按照人类的需要定向改造生物的遗传特性
基因重组（不同物种间）
优点：
能克服远缘杂交不亲和的障碍；
定向改造生物的遗传特性。
课P67 P291
一、重组DNA技术的基本工具　
重组
DNA分子
胰岛素基因
DNA
限制酶
限制酶
DNA连接酶
载体
重组
DNA分子
大肠杆菌
导入
课P70
1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
一、重组DNA技术的基本工具　
课P70
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
6
EcoRⅠ
BamHⅠ
TaqⅠ
Hind Ⅲ
课P71
限制酶所识别的序列有什么特点？
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
能被限制性酶特异性识别的序列一般都是回文序列：即正反读顺序相同，围绕一条轴线对称排列。
读：5’→ 3’
例1：EcoR Ⅰ限制酶的切割
只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
A
A
G
T
T
C
C
T
T
A
A
G
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
C
T
T
A
A
G
G
A
A
T
T
C
课P71
例2：Sma Ⅰ限制酶的切割
只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
课P71
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH Ⅰ: EcoR Ⅰ: Hind Ⅲ: Bgl Ⅱ:
GATC
AATT
AGCT
GATC
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
现学现用：
①获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
②一个基因从DNA分子上切下来，需要切 处，产生 个黏性末端，断 个磷酸二酯键，需要 个水。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
【突破】用限制酶切割时需注意的事项
2
4
4
4
延伸应用
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
图解限制酶的选择原则
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
2.DNA连接酶
一、重组DNA技术的基本工具　
（1）限制酶与DNA连接酶的关系(如下图)：
（2）DNA连接酶与DNA聚合酶的关系(如下图)：
DNA聚合酶
DNA连接酶
DNA连接酶
DNA聚合酶：单个核苷酸与DNA片段
DNA连接酶：DNA片段与DNA片段
DNA聚合酶作用需要模板，而DNA连接酶不需要
2.DNA连接酶
相同点——
作用位点都在磷酸二酯键
不同点——
一、重组DNA技术的基本工具　
　　　项目
种类　　　
作用部位
作用结果
图示
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
形成黏性末端或平末端
磷酸二酯键
连接DNA分子片段
磷酸二酯键
形成新DNA分子
磷酸二酯键
形成脱氧核苷酸
碱基对间的氢键
形成单链DNA分子
相关五种酶的比较
2.DNA连接酶
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
a：磷酸二酯键；b：氢键
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
⑵种类：
思考题：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，
其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
⑴作用：
①将目的基因送入受体细胞
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
3.载体
一、重组DNA技术的基本工具　
⑶载体需具备的条件
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
?真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
3.载体
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
一、重组DNA技术的基本工具　
标记基因对重组DNA的鉴定和选择原理
标记基因通常有:
①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低
延伸应用
(4)质粒
①来源：来源于许多 等
生物，它是一种裸露的、结构简单、
独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我
复制能力的很小的 （化学本质），故质粒有 个游离的磷酸基团
②氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ，还有如：
等；其作用是 。
③复制原点： 。
细菌和酵母菌
双链环状DNA分子
0
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
DNA分子复制的起点
卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因
标记基因
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来
1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为______
2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为______
①或②
①
注意：酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
二、基因工程的基本操作程序　
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶识别和结合位点
启动子
终止子
①不编码蛋白质
编码蛋白质
编码区
（编码序列）
非编码区
（非编码序列）
原核细胞 基因结构
②调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等
编码区
非编码区
非编码区
外显子
内含子
DNA聚合酶
有关的酶
RNA聚合酶
mRNA前体
mRNA
单链DNA
cDNA
逆转录酶
转录
剪接
逆转录
复制
启动子
终止子
基因
真核细胞的基因结构与逆(反)转录法
以mRNA为模板, 逆转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。
(目的基因)
相似名词比较
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}比较项目
位置
功能
启动子
（其上有一个重要的位点：RNA聚合酶结合位点）
起始密码子
终止子
终止密码子
DNA
mRNA
DNA
mRNA
终止翻译
驱动翻译
终止转录
驱动转录
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：
主要指___________的基因，也可以是一些具有_____作用的因子。
编码蛋白质
调控
(2)获取目的基因的方法
②从_________中获取
从____________中获取
从部分基因文库(如cDNA文库)中获取
基因文库
基因组文库
①用_____方法直接人工合成
条件：基因比较小， 已知
方法：通过___________用化学方法直接人工合成
化学
核苷酸序列
DNA合成仪
二、基因工程的基本操作程序　
①全称：
②操作环境：
③原理：
④前提：
⑤条件：
⑥过程：
⑦优点：
聚合酶链式反应
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
可以在短时间内大量扩增目的基因（以指数形式扩增）
DNA半保留复制
已知目的基因的一段核苷酸序列（为了合成引物）
模板DNA、4种游离脱氧核苷酸、引物（1对）、耐高温的DNA聚合酶
变性：
复性：
延伸：
DNA解链（94℃左右）
引物结合到互补DNA链（55℃左右）
Taq酶从引物起始进行互补链的合成（72℃左右）
模板、原料、引物、酶、能量
（本质？如何合成？）
引物是一小段核酸，能与DNA母链的碱基序列互补配对。
通常20-30个核苷酸，人工合成
-PCR
1.目的基因的筛选与获取
二、基因工程的基本操作程序
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸dNTP
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
基本过程
变性 复性 延伸
条件
引物的作用：
——PCR
1.目的基因的筛选与获取
二、基因工程的基本操作程序
94℃左右
55℃左右
72℃左右
使DNA聚合酶能够从引物
的3’端开始连接脱氧核苷酸
PCR扩增仪
过程
目的基因DNA受热变性后________，______与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板在__________作用下进行延伸，即将4种___________加到____________，如此重复循环多次。
解为单链
引物
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
（1）变性
①温度：_____________
②具体变化： ________________
上升到94℃
双链DNA解旋为单链
长度相同但C-G含量高的DNA需要设定的变性温度较高。
（2）复性
①温度：_____________
②具体变化： ____________________________________
下降到55℃左右
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
（3）延伸
①温度：_____________
②具体变化： _____ _______________________________
____________________________________
上升到72℃左右
4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
琼脂糖凝胶电泳的过程
梳子
模具
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
1
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
2
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
3
点样孔
电泳槽
样品
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电容缓冲液没过凝胶1mm为宜。
4
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
5
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为?1?5V/cm2。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
6
取出凝胶，置于300nm紫外灯下观察和照相。
7
课P84
电泳结果的分析
条带
每条泳道有几条条带说明样品DNA中就有几种不同大小的DNA分子，条带的大小表示这种DNA分子数目的多少。
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行　　　　处理。
②每吸取一种试剂后，移液器上的　　都必须更换。
③电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越　，迁移速率越　，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越　，迁移速率越　。
高压灭菌
枪头
大
慢
小
快
DNA的电泳鉴定注意事项：

下列有关电泳的叙述，错误的是 (　 )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度
C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
　
C
青少年型帕金森氏综合征（PD）十分少见，是由Parkin基因突变引起的单基因遗传病，图1是某家族青少年型帕金森综合征的遗传系谱图：图2为正常基因和突变基因上限制酶切割位点以及图1中不同个体DNA酶切并电泳后的条带情况。下列叙述正确的是（ ）
A．应在患者家系中调查该病的发病率
B．该病的遗传方式可能是常染色体隐性遗传或伴X染色体隐性遗传C．若想判断胎儿Ⅲ-1患该病的情况需对其进行性别鉴定
D．图1中Ⅲ-1患该遗传病的概率为1/3
D
PCR技术和DNA复制的比较
思考：通过PCR技术扩增目的基因，与体内DNA复制相比，主要优点是什么？
不需解旋酶、可在短时间内大量扩增目的基因（高效快速）、易于操作
归纳总结

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