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第2章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
第1课时 动物细胞培养
在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。
那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；
人造皮肤
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
从社会中来
人造皮肤 自体皮肤移植
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
动物细胞工程
是最基础的技术
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
原理
地位
对象
目的
细胞有丝分裂
动物细胞工程的基础
胚胎或幼龄动物的细胞
获得细胞或者细胞产物
什么是动物细胞培养？
动物细胞培养所需的基本条件
营养物质
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
二、动物细胞培养的条件
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件。你还记得有哪些条件吗？
充足的营养
稳定的内环境
体外培养动物细胞需要满足什么条件？
二、动物细胞培养的条件
1. 营养条件：
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。
含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求。
培养基的构成：合成培养基 + 血清等天然成分
一般使用液体培养基，也称为培养液。
2. 无菌、无毒的环境
二、动物细胞培养的条件
在细胞培养液中添加适量的抗生素
思考：如何防止培养过程中的微生物污染？
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液
思考：为什么要定期更换培养液？
以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
无菌
无毒
3. 温度、pH和渗透压
（1）适宜的温度：哺乳动物细胞培养的温度多以（36.5±0.5）℃为宜。
（2）适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4。
（3）适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。
二、动物细胞培养的条件
4. 气体环境
二、动物细胞培养的条件
（1）气体组成及作用：
95%空气（O2）：
5%CO2：
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
（2）具体操作：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
CO2培养箱
培养皿
培养瓶
三、动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
细胞悬液
原代培养
用机械的方法， 或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
加培养液
放入培养皿或培养瓶内
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖（悬浮生长）
一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（贴壁生长）
细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液营养物质缺乏等分裂受阻
接触抑制
CO2培养箱中
传代培养：将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理分散成单个细胞，再用离心法收集
大多数细胞
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
(1)取材:
一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。
(2)取材原因:
其细胞生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强。
1.取动物组织
三、动物细胞培养的过程
2. 将组织分散成单个细胞
(1)原因:
(2)方法:
从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。
用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理。
动物细胞间的物质主要是蛋白质。
不行。
思考：进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？
注意：
不能用胃蛋白酶将组织分散成单个细胞，因为胃蛋白酶的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活。
思考：胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？
注意：
动物细胞间的物质主要是蛋白质。使用胰蛋白酶时，应注意控制好作用时间。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，细胞膜也含有蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
能，应注意时间的控制。
分瓶
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
3.制细胞悬液培养
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
②贴壁生长类：
(1)操作方法：
(2)体外培养的动物细胞类型
三、动物细胞培养的过程
【重要概念】
原代培养：指分瓶之前，动物组织经处理后的初次培养。
传代培养：分瓶后的细胞培养。
细胞贴壁：大多数细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。
细胞贴壁生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
培养皿
培养瓶
接触抑制现象：细胞间相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加。
刚开始铺展贴壁生长
贴壁生长并进行有丝分裂
单层相互接触出现接触抑制
正常细胞
平面观
（2）癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞。
肿瘤细胞
失去接触抑制
注意：
（1）正常细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，当细胞相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加，最后形成一层（或单层）。
正常细胞增殖到相互接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制的现象。
癌细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，适宜条件下可以无限增殖。
思考：为什么癌变细胞没有接触抑制现象？
思考：悬浮生长细胞和贴壁生长细胞培养过程有什么不同？
悬浮生长类细胞：
原代培养→分裂受阻→离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。
贴壁生长类细胞：
原代培养→分裂受阻→先胰蛋白酶处理→再离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。
思考：动物细胞培养时，除了添加糖类、氨基酸等必要的营养成分外，往往还需添加血清等一些天然成分，原因是？
人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。
血清等一些天然成分的营养成分比较齐全，可以弥补人工培养基的不足。
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
三、动物细胞培养的过程
归纳总结：植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养过程
培养结果
培养目的
相同点 获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
完整植株
动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
获得大量细胞
快速繁殖等
植物激素
①培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
②均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件。
原代培养、传代培养
脱分化、再分化
（1）动物细胞培养体现了动物细胞的全能性（　 　）
（2）培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞（　 　）
（3）悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集（　 　）
（4）动物细胞培养时，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH（　　 ）
判断常考语句，澄清易混易错
四、干细胞培养及其应用
干细胞的种类
干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括：
1.胚胎干细胞（ES细胞）存在于早期胚胎，能分化为成年动物体内的任何一种类型细胞
2.成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓内的造血干细胞（外周血和脐带血也有）、睾丸中的精原干细胞和神经系统中的神经干细胞。成体干细胞具有组织特异性，只能分化为特定的细胞或组织
3.诱导多能干细胞（iPS细胞）是体外诱导获得的类似胚胎干细胞的一种细胞，在疾病治疗上具有广阔的应用前景
四、干细胞培养及其应用
1.胚胎干细胞：
ES细胞
胚胎干细胞
分布
特点
局限性
实例
早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。
需要分化诱导因子诱导
四、干细胞培养及其应用
成体干细胞
分布
特点
运用实例
实例
成体组织或器官内
具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
造血干细胞→
神经干细胞→
发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例
2.成体干细胞：
四、干细胞培养及其应用
骨髓中的造血干细胞
血细胞和免疫细胞
分化
神经系统中的神经干细胞
分化
神经细胞
睾丸中的精原干细胞
分化
精原细胞
3.诱导多能干细胞：
iPS细胞
①概念
通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞
四、干细胞培养及其应用
各种类型的细胞
导入特定基因
小分子化合物
成纤维细胞
T细胞
B细胞
iPS细胞
分化
移植
②诱导及流程
3.诱导多能干细胞：
iPS细胞
诱导多能干细胞
获取方法
优点
运用
①诱导过程无须破坏胚胎
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。
①将特定基因或特定蛋白导入细胞
②用小分子化合物诱导形成。
①可治疗镰状细胞贫血症
②在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
四、干细胞培养及其应用
4.干细胞应用面临的问题及展望
干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。
（1）面临的问题：存在导致肿瘤发生的风险。
（2）应用展望：
四、干细胞培养及其应用
（1）干细胞都是来源于早期胚胎 （ 　　）
（2）iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，可以避免免疫排斥反应 （　 　）
（3）不同类型的干细胞，它们的分化潜能完全相同 （ 　　）
（4）干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用 （　　 ）
判断常考语句，澄清易混易错
练习与应用（P47）
1. 判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖（ ）
×
√
×
×
一、概念检测
2. 干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是（ ）
A. 干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B. 造血干细胞可以分化为各种血细胞
C. 不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的
D. 由iPS细胞产生的特定细胞，可以在新药的测试中发挥重要作用
练习与应用（P47）
一、概念检测
A
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用

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