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(共42张PPT)
第3章 第2节
基因工程的基本操作程序
第二课时
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
问题思考
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
第三步
将目的基因导入受体细胞
（常用）
基因枪法
（单子叶植物常用）
②在植物授粉后一定时间内，剪去 ，将DNA溶液滴在 ，使目的基因通过 进入 。
①用微量注射器将 溶液直接注入 中；
花粉管通道法导入外源DNA
适用生物：开花植物
（1）花粉管通道法（我国独创）
1.目的基因导入植物细胞
含目的基因DNA
子房
柱头
花柱切面
花粉管通道
胚囊
第三步
将目的基因导入受体细胞
实例：
我国“转基因抗虫棉”
优缺点：
简便经济（优点）
要求花朵较大（缺点）
①转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
（2）农杆菌转化法
1.目的基因导入植物细胞
第三步
将目的基因导入受体细胞
②原理：
①农杆菌能在自然条件下侵染 植物和 植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。
双子叶
裸子
Ti质粒
T-DNA
染色体DNA
可转移的DNA
（可转移的DNA）
③方法：
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等，
1.目的基因导入植物细胞
第三步
将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化法
目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达④过程：第三步将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA中重组DNA转入农杆菌农杆菌侵入植物将目的基因带入植物细胞含外源目的基因的重组DNA整合到植物细胞的基因组中目的基因遗传特性稳定维持和表达 1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养
第三步
将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化法
该过程经过____次拼接、____次导入
①第一次拼接：_______________________________
②第二次拼接： _______________________________
_______________________________
③第一次导入：__________________________________
④第二次导入：__________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
农杆菌将含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
拓展—拼接&导入
（1）导入方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
①体积大，易操作。
②易表现出全能性。
（3）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
第三步
将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
（移植到同期发情的母畜子宫内）
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
知识拓展
病毒介导法（主要用于导入动物细胞）
第三步
将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
Ca2+处理
原核细胞（常选择大肠杆菌）
（2）受体细胞：
Ca2+
感受态细胞
吸收
第三步
将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
优点：
繁殖周期短 体积小易于培养操作
多为单细胞 遗传物质相对较少
使用Ca2+处理：
增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）
小结：将目的基因导入受体细胞的方法
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法
受体 细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
问题思考
在抗虫棉的培育过程中，目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
PCR等技术检测
抗原 — 抗体杂交技术
分子
水平
抗虫鉴定
（个体水平）
第四步
目的基因的检测与鉴定
(1)分子检测
(2)个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
第四步
目的基因的检测与鉴定
1.目的:
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
2.概念
（1）借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传
（2）基因探针：
一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。
（3）核酸杂交：
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，
如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
第四步
目的基因的检测与鉴定
3.检测内容及方法:
（一）分子水平的检测
检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
①检测目的基因是否导入
——方法1：通过PCR等技术检测
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
DNA半保留复制
第四步
目的基因的检测与鉴定
基本思路：
①制作基因探针，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
探针与受体中的DNA分子杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已插入
未插入
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
第四步
目的基因的检测与鉴定
——方法2：DNA分子交杂技术
变性
1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针；
2、使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，则导入成功。
原理：碱基互补配对原则
①检测目的基因是否导入
检测Bt基因是否翻译出mRNA
提取棉花细胞mRNA
逆转录
产生DNA
对扩增产物进行检测
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
②检测目的基因是否转录
——方法1；通过PCR等技术检测
（一）分子水平的检测
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
第四步
目的基因的检测与鉴定
②检测目的基因是否转录
——方法2：分子杂交技术
1、制作基因探针；
2、探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了mRNA。
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
杂交分子
（可检测）
原理：碱基互补配对原则
第四步
目的基因的检测与鉴定
③检测目的基因是否翻译
——通过抗原-抗体杂交检测
从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
抗原
抗体
杂交
脱分化
第四步
目的基因的检测与鉴定
从棉花中
提取蛋白质
用相应抗体进行
抗原-抗体杂交检测
检测目的基因是否表现出相应的性状
检测抗虫棉是否具有抗虫性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
（二）个体水平的检测
第四步
目的基因的检测与鉴定
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上 是否插入了目的基因 PCR扩增
DNA分子杂交技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR扩增
分子杂交技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平 鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测， 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
课堂小结
基因工程的基本操作程序
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
琼脂糖凝胶电泳
思考：如何对PCR扩增的产物进行鉴定？
1、实验原理
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些_______ 会向着________________ 的电极移动，这个过程就是_____。
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定
琼脂糖凝胶电泳
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
染色
300nm
紫外灯
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关。
凝胶的浓度
DNA分子的大小
构象
DNA片段的扩增及电泳鉴定
2、材料用具
PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1gp～1μg ①加液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
（1）DNA片段的扩增
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
（2）DNA片段的电泳鉴定
①配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
②制备凝胶
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、方法步骤
③加样
：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
④电泳：
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑤观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察
和照相
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（2）DNA片段的电泳鉴定
注意:
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4.结果分析与评价
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
【三点提醒】
①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。
因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
练习与应用
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
D
练习与应用
一、概念检测
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。

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