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第3章 第2节
基因工程的基本操作程序
第一课时
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）
从社会中来
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
【培育转基因抗虫棉的简要过程】
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
（核心步骤）
1、目的基因
（1）概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物 等的基因。
（2）作用:根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要指编码蛋白质的基因。
（3）实例:与生物抗逆性相关的基因
与生物药物相关的基因
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
第一步
目的基因的筛选与获取
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白的抗虫原理：
思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌半孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破环鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
培育转基因抗虫棉用到的目的基因
Bt 抗虫蛋白基因
简称 Bt 基因
（1） 实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因
是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
01
目的基因的筛选与获取
第一步
目的基因的筛选与获取
2、筛选合适的目的基因
（2） 较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（3）认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、
序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
01
目的基因的筛选与获取
第一步
目的基因的筛选与获取
2、筛选合适的目的基因
（1）人工合成目的基因
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。
DNA合成仪
转基因抗虫棉
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪用化学方法直接自动合成。
3．目的基因获取的方法
第一步
目的基因的筛选与获取
3．目的基因获取的方法
第一步
目的基因的筛选与获取
（2） 通过构建基因文库来获取目的基因
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因文库：
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克
隆群体。
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的
克隆群体。
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
某生物体内全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体
基因文库的构建
限制酶
与载体连接 导入
基因组文库
基因组文库
某生物某个时期的mRNA
cDNA（互补DNA）
逆转录
受体菌群体
与载体连接 导入
部分基因文库
（如：cDNA文库）
基因文库的构建
cDNA文库
【说明】基因文库中不是直接储存相应基因，而是保存受体菌，受体菌中含有基因。
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
第一步
目的基因的筛选与获取
（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3．目的基因获取的方法
概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据________________的原理，在体外提供______________的各种组分与反应条件，对_____________________进行大量复制的技术。
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
参与DNA复制
目的基因的核苷酸序列
PCR扩增仪
①
②【重温】DNA复制的过程
解旋
合成子链
形成新DNA
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
解旋
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
合成子链
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
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C
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G
C
T
T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
DNA聚合酶形成磷酸二酯键
子链延伸合成的方向？
只能从5′－端→3′－端延伸
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
重新螺旋形成新的DNA分子
复制特点：
①边解旋边复制 ②半保留复制
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
复制原则：
体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
（通常为小的单链RNA）
无需解旋酶，用高温代替
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
(Taq酶）
人工合成的引物
（通常为小的单链DNA）
反应还需要其它条件，如能量、缓冲液等
②PCR和DNA的体内复制是否完全相同？
PCR技术所需
条件
耐高温的DNA聚合酶
DNA模板
引物
缓冲溶液
四种脱氧核苷酸
微量离心管
（dNTP）
（2种）
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
（一般添加Mg2+）
PCR的条件：
目的基因DNA(模板)、四种游离的脱氧核苷酸、耐高温DNA聚合酶、引物、一定的缓冲溶液(维持反应体系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性） 控制温度变化
根据体内DNA复制所需的基本条件及基本过程，阅读P77最后一自然段以及P78-79的图3-5和有关文字，总结PCR技术所需的条件和基本过程。
引物是一小段能与________的一段碱基序列________的___________。
用于PCR的引物有 种，长度通常为20~30个核苷酸。
DNA母链
互补配对
短单链核酸
2
第一步
目的基因的筛选与获取
前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物
（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物结合在
模板链的3’端
3′
5′
子链的延伸方向是5 ′→3 ′？
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
子链
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端
子链合成需要引物？
第一步
目的基因的筛选与获取
（3）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
①变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
③延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
引物
DNA模板
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
PCR反应的过程
PCR扩增仪
③
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
③PCR反应的过程
1）变性：
当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
90℃
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
2）复性：
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。
碱基互补配对
3）延伸：
当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
72℃
思考：为什么温度要上升至72℃？
思考：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
第二轮循环的产物
第三轮的产物
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
第一轮循环的产物
3’
5’
3’
5’
④PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
思考
获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？
至少要三次循环。
第一轮产生的子链长度小于模板链长度，到第三轮循环时，才出现2个两条脱氧核苷酸链等于目的基因。
扩增次数 第1次 第2次 第3次 第n次
DNA分子数
含引物A(或B) 的DNA分子数
同时含引物A、B的DNA分子数
共消耗的 引物数量
2
2
0
4
6
8
14
2
6
2n
2n+1-2个
2n-2
1
3
7
2n-1
⑤PCR扩增DNA规律
2n－1对
复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，
原因是：
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之问的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
思考
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
【补充】基因的结构
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
基因通常是有遗传效应的DNA片段
能编码特定的蛋白质
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA进一步编码（翻译）
出蛋白质的DNA区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的、不间隔的
非编码区：
含有能调控遗传信息表达的DNA序列
不转录，不编码蛋白质
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
间隔的、不连续的
外显子：
内含子：
数量关系：外显子=内含子 + 1
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列
转录
初级RNA
成熟mRNA
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
【思考】真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？
剪切、拼接
DNA聚合酶
单链DNA
cDNA
逆转录酶
逆转录
复制
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
(1)根据不同的需要，目的基因是不同的，但都是能编码蛋白质的基因( )
(2)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。( )
(3)PCR的每一个循环都包括变性→复性→延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。( )
×
×
√
【基础过关】
【当堂训练】
关于PCR技术的说法不正确的是(　 　)
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温的酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和四种核糖核苷酸
D
下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是(　　)
D
A.①过程所需的原料是核糖核苷酸
B.②过程所需的酶必须耐高温
C.③过程需要解旋酶破坏氢键
D.④过程的引物对之间不能互补配对
获取了足够量的目的基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使基因能够表达和发挥作用。能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？
构建基因表达载体（核心工作）
基因表达载体由哪些部分组成
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
1.构建基因表达载体的目的：
2.基因表达载体的组成
思考：要各个元件有什么作用？
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
01
目的基因的筛选与获取
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状，必须插到启动子
和终止子之间
启动子：
本质：有特殊序列结构的DNA片段
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识
别和结合的部位，驱
动基因转录出mRNA
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
本质：有特殊序列结构的DNA片段
位置：基因的下游
功能：终止转录
四环素抗性基因、荧光蛋白基因等
标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
载体≠表达载体：
1.二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
2.表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
【区分两组概念】
特殊序列结构的DNA片段
位于mRNA上
翻译的起始点
翻译的终点
转录的起始点
转录的终点
本身不转录
决定氨基酸
不决定氨基酸
基因表达载体
第二步
基因表达载体的构建——核心步骤
3.基因表达载体的构建过程
同种限制酶或能产生相同末端的限制酶
①首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
②然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
③再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
载体
载体（质粒）
DNA分子（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
培育抗虫棉的简要过程
使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解决这一问题？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，
防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
（1）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选。若被破坏，无法进一步筛选。
思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？
请结合下图，回答问题：
（2）只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？
如果能，有何弊端？
能
①质粒、目的基因会发生自身环化连接；
②会发生两两自身连接；
③质粒与目的基因会发生反向连接。
思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？
请结合下图，回答问题：
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
①可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；
②还可以防止目的基因与载体的反向连接。
思考：构建基因表达载体过程中，如何避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（保证目的基因和质粒发生定向连接）？
请结合下图，回答问题：
【核心归纳】图解限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因原则：
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
（3）确保出现相同黏性末端原则：
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？
可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
（4）保证目的基因和质粒发生定向连接
难点剖析
1.前面说用应该同一种限制酶切割载体和目的基因，现在又说应该用不同的限制酶切割载体和目的基因，两种说法是否冲突？
不冲突，用不同的酶是指不管是切割载体还是切割目的基因，最好都用两种限制酶切，保证不管是载体还是目的基因，其本身左右两侧的切口不同，不会自身环化。
而为了保证目的基因和载体能连接，就要求不管目的基因用的什么种类的限制酶切，载体也应该用同一种限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，则载体也应该用酶1和酶2切。
难点剖析
2.目的基因应该插入到载体的哪个部位？如果目的基因插入到标记基因或复制原点中，该基因表达载体还能用么？如何避免这种现象？
（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，才能保证目的基因的正常转录。
（2）目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等各个结构都不得含有限制酶识别序列，否则会影响表达载体的构建。
（1）基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 （　 　）
（2）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子 （　 　）
（3）标记基因不一定是抗生素抗性基因 （　 　）
（4）当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因
的表达（　 　）
课堂练习
2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 (　 　)
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
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