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课前提问
第3章基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
（3课时）
本节聚焦
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
苏云金杆菌
普通棉花（无抗虫特性）
3.将目的基因导入受体细胞
棉花细胞
转基因抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
4.目的基因的 检测与鉴定
情境再现
与载体拼接
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？
1.什么样基因才能称为目的基因？举例说明？
2.筛选合适的目的基因的方法？
3.明确目的基因后，该如何获得它？
任务：阅读教材76-77，解决问题：
第一步：目的基因的筛选和获取
主要指的是编码蛋白质的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
① ；
② ；
③ 。
人工合成
利用PCR获取和扩增目的基因
构建基因文库（P82第5段第1、2行)
？？
利用PCR获取和扩增目的基因：
任务：阅读教材77-79，解决问题：
1.PCR的全称？
2.PCR是一项怎样的技术（概念）？
（据概念分析）PCR依据的原理？操作环境？优点？
3.回忆体内DNA复制需要什么条件？
从而分析PCR需要哪些条件？
4.PCR的过程？
DNA半保留复制
体外
短时间内大量扩增目的基因
聚合酶链式反应
参与组分 在DNA复制(体内)中的作用 PCR中参与的组分
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
不用，用高温代替
DNA模板
4种脱氧核苷酸
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
2种引物
PCR所需的基本条件：
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。
需要在一定的缓冲溶液中才能进行
（一般要添加Mg2+）
PCR 每次循环一般可分为 、 和 三步
当温度超过_____以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
待扩增的DNA片段
①变性：
变性
90℃
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
变性
延伸
复性
当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。
3’
5’
3’
5’
碱基互补配对
思考：引物结合在模板链的什么位置？
引物结合在模板链 端，引导子链从 方向复制。
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
②复性：
50℃
两
由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物
PCR 每次循环一般可分为 、 和 三步
变性
延伸
复性
3'
5'端→3'端
当温度上升到____左右时，溶液中的4种__________在__________DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
脱氧核苷酸
72℃
③延伸：
耐高温的
3’
5’
3’
5’
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
3’
3’
PCR 每次循环一般可分为 、 和 三步
变性
延伸
复性
由此可见：
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚和结合！
（P84第一段）
耐高温的DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶
如此重复循环多次，由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
PCR的结果：
PCR扩增仪
1.引物在PCR中能重复利用吗？
假设有一个亲代DNA，通过PCR获得2n个DNA需要 个引物？
不能
2.新冠病毒的遗传物质是RNA，核酸检测能用PCR直接扩增它的RNA吗？
应先将RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增。
思考·讨论
(2n-1)×2
PCR不能直接扩增RNA
(P79旁栏思考)
练习与应用
4.(2021·佛山)实时荧光RT-PCR技术可快速检测新型冠状病毒的核酸，为疫情防控提供了有力保障。检测原理如下图所示，探针是含荧光基团并有特定序列(新冠RNA序列)的DNA单链。
下列说法错误的是 (　　)
A.逆转录和杂交DNA扩增所需的原料相同 B.逆转录、扩增和分子杂交中碱基配对情况相同 C.病毒RNA的遗传信息通过逆转录传递给单链DNA D.逆转录和杂交DNA扩增所需酶种类不同
B
原理：用有特定碱基序列的荧光探针进行检测，测定荧光产生的情况
琼脂糖凝胶电泳
电泳原理（P84）
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这此基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这此带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
5.PCR产物鉴定方法：
（小的跑得快，大的慢）
紫外灯下观察电泳结果
（生物必修二DNA的结构章节内容）
7.若用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是( )
练习与应用
A.图中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道①中是用Sal 处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
D
练习与应用
10.现有一长度为3 000 碱基对(bp)的线性 DNA 分子,用限制性内切核酸酶酶切后,进行凝胶电泳,使降解产物分开。用酶 H 单独酶切,结果如图 1。用酶 B 单独酶切,结果如图 2。用酶 H 和酶 B 同时酶切,结果如图 3。该 DNA分子的结构及其酶切图谱是( )
A
--- 核心工作
4.基因表达载体的构建过程
任务：阅读教材P80，解决问题：
第二步：基因表达载体的构建
让目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；同时，使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.载体和基因表达载体的区别？
为什么要构建基因表达载体？
3.基因表达载体应该具备什么结构才能到达以上目的？
各个结构的作用？
目的基因插入什么位置？
1.获取目的基因后，能直接导入受体细胞吗？
不能，需借助载体
基因表达载体
2.基因表达载体的组成
位于基因上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA
插入启动子和终止子之间
位于基因的下游，终止转录
DNA复制所需
目的基因
启动子
复制原点
终止子
标记基因
用来鉴别或筛选含有目的基因（或重组DNA分子）的细胞
重组DNA分子
启动子和起始密码子有区别吗？终止子和终止密码子有区别吗？
启动(终止)转录
启动(终止)翻译
位于DNA上
位于mRNA上
作用
位置
启动(终止)子
起始(终止)密码子
3.基因表达载体构建的过程：
质粒
载体
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
限制酶切割位点
限制酶
用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
DNA连接酶
重组DNA分子
基因表达载体
对切割质粒和目的基因的限制酶有什么要求？
获取目的基因
活动一：用同一种限制酶切割目的基因和质粒，用DNA连接酶连接后得到哪些分子？
①目的基因和质粒能否正确连接？
②目的基因与质粒能否反向连接？
③目的基因能否自连或自身环化？
④质粒能否自连或自身环化？
合作 · 探究
如：用Ecol RⅠ限制酶（识别GAATTC，切割GA之间）切割载体和目的基因。
×
活动二：如何防止目的基因或质粒的自身环化以及目的基因和质粒的反向连接？
用两种不同的限制酶同时对目的基因和载体进行切割
√
限制酶的选择原则？
技法提升
(1)不破坏目的基因：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
某目基因两侧的 DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是(　　)
　　　　　　　　
A　　　　　　 B C　　　　　　 D
A
练习与应用
练习与应用
例：图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为　　　　　　　　　　。
(2)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　
。
(3)构建基因表达载体时,可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA,但会导致
　　　　　　　　　　　　　　　　 等问题,为
避免以上问题出现,应使用　 　　　　　　 两种限制酶。
SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因
BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)
限制酶和DNA连接酶
目的基因或质粒的自身环化以及目的基因和质粒的反向连接
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
阅读教材P81和P82倒数1.2段，归纳导入方法：
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞：
1.转化的概念？
2.农杆菌的特点？
3.转化过程？
4.转化方法？
①②
受精卵
常用受体细胞：
大肠杆菌
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
花粉管通道法
适用生物：开花植物
（我国科学家独创）
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
三
第三步：将目的基因导入受体细胞
花粉管通道法
适用生物：开花植物
（我国科学家独创）
三
Ti质粒
T-DNA
（可转移的DNA）
目的基因
构建表达载体
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
导入植物细胞
将目的基因插入
染色体 DNA 中
第1次拼接
第2次拼接
第1次导入
第2次导入
该过程涉及两次拼接和两次导入，你能总结吗？
农杆菌转化法（转化过程）
第四步：目的基因的检测与鉴定
在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
1.分子水平检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
用抗虫棉叶片饲喂棉铃虫实验(抗虫接种实验)
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
PCR技术、
分子杂交技术
抗原-抗体杂交
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒(菌)植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病症
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
个体水平鉴定转基因生物的遗传特性
方法归纳
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
一、概念检测
P83 练习与应用
研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
二、拓展应用
P59 练习与应用
DNA 片段的扩增 及 电泳鉴定

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