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高中生物一轮复习
第40课 基因工程（2）
思维导图
重组DNA技术的基本工具　
重组
DNA分子
胰岛素基因
DNA
限制酶
限制酶
DNA连接酶
载体
重组
DNA分子
大肠杆菌
导入
课P70
1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
重组DNA技术的基本工具　
课P70
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端
黏性末端
2.DNA连接酶
重组DNA技术的基本工具　
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
⑵种类：
思考题：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，
其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
⑴作用：
①将目的基因送入受体细胞
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
3.载体
重组DNA技术的基本工具　
(4)质粒
①来源：来源于许多 等
生物，它是一种裸露的、结构简单、
独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我
复制能力的很小的 （化学本质），故质粒有 个游离的磷酸基团
②氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ，还有如：
等；其作用是 。
③复制原点： 。
细菌和酵母菌
双链环状DNA分子
0
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
DNA分子复制的起点
卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因
标记基因
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序　
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶识别和结合位点
启动子
终止子
①不编码蛋白质
编码蛋白质
编码区
（编码序列）
非编码区
（非编码序列）
原核细胞 基因结构
②调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等
编码区
非编码区
非编码区
外显子
内含子
DNA聚合酶
有关的酶
RNA聚合酶
mRNA前体
mRNA
单链DNA
cDNA
逆转录酶
转录
剪接
逆转录
复制
启动子
终止子
基因
真核细胞的基因结构与逆(反)转录法
以mRNA为模板, 逆转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。
(目的基因)
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸dNTP
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
基本过程
变性 复性 延伸
条件
引物的作用：
——PCR
1.目的基因的筛选与获取
94℃左右
55℃左右
72℃左右
使DNA聚合酶能够从引物
的3’端开始连接脱氧核苷酸
PCR扩增仪
基因工程的基本操作程序　
(1)利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA复制。
②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
③扩增过程
过程 说明 图解
变性 温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　　　　的原料，又可为DNA的合成提供　　。
(2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　　，一般为RNA片段。
(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。
DNA子链
能量
RNA单链
引物
Mg2＋
Mg2＋
PCR技术和DNA复制的比较
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律
PCR技术和DNA复制的比较
需要引物的原因？
DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。
(3)人工合成目的基因
①逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：
②化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：
(4)从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
基因组文库 （包含一种生物的所有基因）
部分基因文库（包含一种生物的一部分基因）
（cDNA文库）
基因文库类型:
cDNA：先由mRNA在逆转录酶作用下获得单链DNA，再利用DNA聚合酶，将单链DNA复制，产生双链DNA，即为cDNA。
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行　　　　处理。
②每吸取一种试剂后，移液器上的　　都必须更换。
③电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越　，迁移速率越　，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越　，迁移速率越　。
高压灭菌
枪头
大
慢
小
快
DNA的电泳鉴定注意事项：
PCR技术和DNA复制的比较
2
基因表达载体的构建
---基因工程的核心
(1)目的：使目的基因　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
启动子
标记基因
基因工程的基本操作程序　
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
问题：该过程需要用到基因工程哪些工具？
2
基因表达载体的构建
---基因工程的核心
基因工程的基本操作程序　
问题探讨：
1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
基因工程的基本操作程序　
2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
问题探讨：
-G
-CTTAA
3.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
基因工程的基本操作程序　
下列哪项不是基因表达载体的组成成分( )
A.启动子 B.终止密码子 C.标记基因 D.复制原点
[解析] 启动子、标记基因、复制原点是基因表达载体的组成成分，终止密码子是mRNA上的三个碱基，终止翻译的作用，B错误。
B
生物种类 植物 动物 微生物
常用方法 　　　
受体细胞
转化过程
受精卵
Ca2＋处理法
花粉管通道法
体细胞或受精卵
3
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法(常用）
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
显微注射法
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
原核细胞
Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
课P80
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
（1）花粉管通道法：
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。
我国科学家独创的一种方法
课P81
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持__________
的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是　　　　。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的　　　　上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的　　　　　　上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入　　　，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入　　　　。
稳定和表达
基因重组
T－DNA
染色体DNA
农杆菌
受体细胞
(3)农杆菌特点
①能在自然条件下侵染　　　　　和　　　　，而对大多数___________没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有　　　，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
Ti质粒
用农杆菌感染时，优先选择 （受伤的/完好的）叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是 。
受伤的
叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌
Ti质粒
T-DNA
目的基因
构建表达载体
含目的基因的Ti质粒
转入农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现新性状的植物
植物细胞
染色体DNA
方法技巧：农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T DNA 上；
第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的 T DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
第一次导入是将含目的基因的 Ti 质粒导入农杆菌；
第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的 T DNA 导入受体细胞。
B.将目的基因导入动物细胞
①方法: 。
②受体细胞： 。
显微注射技术
受精卵
【思维拓展】为什么受体细胞选受精卵而不是正常体细胞？
受精卵体积大,易操作，全能性高，易培养成完整个体；而动物体细胞的全能性受限。
③过程：
提纯含目的基因的表达载体
取受精卵
显微注射
受精卵发育
早期胚胎
移植到子宫
新性状动物
将目的基因导入微生物细胞
①常用法: .
②常用菌： 。
③微生物作为受体细胞的原因是 。
④过程：
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
Ca2+处理法(感受态细胞法)
大肠杆菌
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
⑤受体细胞用Ca2+处理的目的是 。
⑥用Ca2+处理受体细胞是通过改变 的通透性来完成
使其变为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子
细胞壁
4
目的基因的检测与鉴定
检测水平 检测目的 检测方法
分子 水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 ________
目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 _________________
个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验
PCR
抗原—抗体杂交
⑴检测与鉴定的目的：
检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
⑵检测与鉴定的方法：
①.分子水平检测
Ⅱ.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
Ⅰ.DNA分子探针：
放射性同位素标记的含有目的基因的DNA片段
DNA分子杂交技术
转基因生
物的DNA
探针
15N
变性
15N
杂交DNA分子（可检测）
变性
4
目的基因的检测与鉴定
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
转基因生
物的DNA
探针
变性
15N
杂交DNA分子（可检测）
变性
个体生物学水平的鉴定—— 个体是否具有相应性状
方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、
抗虫或抗病接种实验
与天然产品的功能进行活性比较
接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。
课P81
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
目的基因检测与鉴定的方法比较：
下列关于基因工程的叙述，正确的是 (　 )
A．培育转基因动物时选择的受体细胞只能是动物的受精卵
B．构建重组质粒时必须选择相同的限制性内切核酸酶处理载体质粒与目的基因
C．经检测发现抗除草剂基因成功导入某抗盐植物，该植物一定具有抗除草剂及抗盐性状
D．用氯化钙处理大肠杆菌，增加其细胞壁的通透性，可提高重组DNA分子的导入成功率
D
胚胎干细胞或核移植形成的重组细胞

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