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第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
什么是基因工程？
基因工程是如何进行操作的？
基因工程
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
操作对象及环境
操作水平
操作原理
结果
基因
DNA分子水平
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因重组
优点：
能克服远缘杂交不亲和的障碍；
定向改造生物的遗传特性。
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
（1）DNA的基本组成单位都是 。
（2）双链DNA分子的空间结构都是 。
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
（1） 是控制生物性状的独立遗传单位。
（2）遗传信息的传递和表达都遵循 。
（3）生物界共用一套 。
四种脱氧核苷酸
规则的双螺旋结构
基因
中心法则
遗传密码
基因工程理论基础的分析
1’
2’
3’
4’
5’
脱氧核苷酸
聚合成
3’
5’
一条脱氧核苷酸链
3’，5’-磷酸二酯键
形成
两链之间：
A、T间形成2个氢键，C、G间形成3个氢键
A
C
T
G
DNA双链平面结构
--
--
--
--
--
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
重组DNA技术的基本工具
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制性内切核酸酶：切割DNA分子的工具，简称限制酶
1.来源：
2.种类：
主要从原核生物中分离纯化出来
迄今分离的限制酶有数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
资料卡-限制酶的命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。
练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______；
SmaⅠ
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3.作用：
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
“两个特定”
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
磷酸二酯键
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
识别序列：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；
也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
特点1：都可以找到一条中（心）轴线；
特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致
3.作用：
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
4.切割结果
实例1——EcoR Ⅰ限制酶
识别特定序列为GAATTC；
切割特定部位为G、A之间的磷酸二酯键
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
黏性末端　　　　
黏性末端
黏性末端：
…TTAA
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
实例2——Sma Ⅰ限制酶
识别特定序列为CCCGGG；
切割特定部位为C、G之间的磷酸二酯键
当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。
平末端　平末端
4.切割结果
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ ________
GATC
AATT
AGCT
GATC
*思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
思考：
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
缺口怎么办？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。
2.DNA连接酶的种类：
种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能特性
相同点 大肠杆菌
T4噬菌体
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来；
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端；
恢复的都是磷酸二酯键
不能连接具有平末端的DNA片段。
又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
3.E·coli DNA连接酶连接黏性末端的作用
两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来。
把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来；，
DNA连接酶将两个双链DNA片段“缝合”连接起来，形成一个双链DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。
4.T4 DNA连接酶的缝合作用
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
5.比较DNA连接酶与DNA聚合酶
A A T T G
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶的作用
C
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
5.比较DNA连接酶与DNA聚合酶
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
拓展：与DNA相关的几种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
2.种类：
质粒、噬菌体和动植物病毒等。
种类 用途 不同点
质粒、噬菌体
植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
拟核DNA
质粒
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.作为载体需具备的条件
（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
（2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
（3）常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量
（4）无毒害作用
避免受体细胞受到损伤
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
【核心探讨】标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
思考 讨论 重组DNA分子
思考 讨论 重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能；因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
一、提取生物大分子的基本思路：
实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。
1.提取原理
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
二、提取生物大分子的提取原理与鉴定原理
2.鉴定原理
在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
三、材料用具
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
1.选材：
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑；选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
三、材料用具
2.试剂：
①研磨液：
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA
四、方法步骤
取材、研磨
过滤或离心取上清液
预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
四、方法步骤
1.取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。
（1）研磨的目的：
破碎细胞，使核物质溶解在研磨液中
充分研磨：
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量
（2）研磨时间不宜太长：
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
（3）研磨不宜太用力；
（4）有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶。
研磨效果好（有利于充分研磨）
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
四、方法步骤
2.过滤或离心取上清液：
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
（1）过滤能用滤纸代替吗？
不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
（2）上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
（3）低温放置几分钟的作用：
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂。
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
四、方法步骤
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
（1）搅拌时应轻缓、并沿一个方向：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
（2）酒精预冷的作用:同“低温放置的作用”
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
四、方法步骤
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
五、结果分析与评价
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
六、进一步探究
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
探究实践 - DNA的粗提取与鉴定
拓展探究：
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
以血液（如鸡血细胞）为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
练习与应用
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
C
A
练习与应用
二、拓展应用
有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么
XbaⅠ
因为Xba I与Spe I切割产生了相同的黏性末端。
练习与应用
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
二、拓展应用

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