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(共50张PPT)
普通棉花
转基因抗虫棉
将苏云金芽孢杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。
如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？
问题探讨
苏云金芽孢杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
问题探讨
第二节 基因工程的基本操作程序
专题一 基因工程
阅读课本8-15页，基因工程的基本操作程序
思考并完成导学提纲
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
1
2
3
4
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
转录
DNA
RNA
翻译
蛋白质
逆转录
复制
复制
中心法则——克里克
基因的表达：指的是转录和翻译的过程。
基因是有遗传效应的DNA片段
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。
非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。
基因是有遗传效应的DNA片段——原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因上游
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的
终止子
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因下游
终止转录
基因是有遗传效应的DNA片段——原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
间隔的、不连续的
内含子
外显子
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。
基因是有遗传效应的DNA片段——真核细胞的基因结构
启动子
终止子
内含子
外显子
转录
hnRNA(mRNA的前体）
成熟mRNA
加工
基因是有遗传效应的DNA片段——真核细胞的基因结构
思考：真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时是否转录？
蛋白质
翻译
项目 原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都有能够编码蛋白质的 和 具有调控作用的 区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
非编码序列
= 非编码区
原核基因：
非编码序列
真核基因：
= 非编码区 + 内含子
基因是有遗传效应的DNA片段
第一步 目的基因的获取
一.目的基因
（1）概念：
与生物抗逆性、优良品质、生物药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（Bt抗虫蛋白基因：转基因抗虫棉）。
主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子
（2）实例：
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
基因组文库（包含一种生物的所有基因）
部分基因文库（包含一种生物的一部分基因）
（如cDNA文库）
基因文库类型:
方法一：从基因文库中获取目的基因
方法二：人工合成
方法三：利用PCR技术扩增目的基因
第一步 目的基因的获取
（1）构建基因组文库
提取某生物
全部DNA
用适当
限制酶切割
许 多
DNA片段
该生物
基因组文库
每个受体菌含有一段不同的DNA片段
与载体连接
导入受体菌群
方法一：从基因文库中获取目的基因
二.目的基因的获取方法
第一步 目的基因的获取
（2）构建cDNA文库——mRNA逆转录形成
mRNA
杂交双链
单链DNA
双链cDNA
(cDNA)
该生物
cDNA文库
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子，
cDNA文库中的基因不含以上结构。
与载体连接
导入受体菌群
逆转录酶
核酸酶
DNA聚合酶
方法一：从基因文库中获取目的基因
提取某种生物的全部DNA
多个一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接，导入受体菌中储存
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建
基因组文库的构建
某种生物的单链mRNA
单链互补DNA
双链cDNA片段
导入受体菌中储存
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
构建
cDNA文库构建
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
方法三：利用PCR技术扩增目的基因
PCR是多聚酶链式反应的缩写，根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
概念
原理：
DNA双链复制
第一步 目的基因的获取
体内DNA复制要点回顾
（1）条件
原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）
模板：DNA的两条链
酶：解旋酶、DNA聚合酶等
能量：ATP
（2）复制原则：
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
4种脱氧核苷酸
引物（2种）
模板DNA
5’
5’
变性
(90~95℃）
复性
(55~60℃）
延伸
(70~75℃）
温度上升到90℃以上，双链DNA解旋为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸热稳定DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
第一步 目的基因的获取
缓冲液
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20-30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
什么是引物
第一步 目的基因的获取
子链延伸
子链延伸
引物是决定PCR特异性的关键。
-5 ′
3 ′ -
引物
5 ′ -
-3 ′
5 ′ -
-3 ′
引物
3 ′ -
-5 ′
（3）利用PCR技术扩增目的基因条件
①____：DNA的两条链。
②____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。
③原料：A、T、G、C四种__________。
④酶：______________________
⑤其他条件：需要一定的 溶液和能严格控制温度的温控设备。
模板
引物
脱氧核苷酸
热稳定DNA聚合酶(Taq酶）
缓冲
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，
因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，
即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
第一步 目的基因的获取
第一步 目的基因的获取
过程
模板DNA
变性 复性 延伸
方法三：利用PCR技术扩增目的基因
5’
5’
3’
3’
95℃
二.目的基因的获取方法
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
过程
95℃
1.变性：加热至90～95℃，双链DNA间的氢键断裂，解旋为单链。
变性 复性 延伸
—利用PCR技术扩增目的基因
5’
3’
5’
3’
使用耐高温的Taq酶保证高温条件下仍具有活性。
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
50℃
引物1
引物2
DNA引物
2.复性：冷却至55～60℃，两条引物与单链DNA结合
过程
变性 复性 延伸
5’
3’
5’
3’
引物结合在模板DNA链的3’端，新合成的子链方向为5’到3’。
—利用PCR技术扩增目的基因
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
过程
引物1
引物2
72℃
Taq酶
Taq酶
变性 复性 延伸
3.延伸：加热至70～75℃，以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
—利用PCR技术扩增目的基因
第1轮结束
第2轮开始
第一轮结束：此时目的基因的量是原始的2倍。
过程
变性 复性 延伸
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
—利用PCR技术扩增目的基因
第1轮结束
第2轮开始
第一轮结束：此时目的基因的量是原始的2倍。
过程
变性 复性 延伸
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
—利用PCR技术扩增目的基因
过程
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
变性 复性 延伸
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
—利用PCR技术扩增目的基因
过程
95℃
50℃
72℃
Taq
Taq
Taq
Taq
变性 复性 延伸
第一步 目的基因的获取
二.目的基因的获取方法
—利用PCR技术扩增目的基因
第2轮结束
第二轮结束：此时目的基因的量是原始的22倍。
过程
变性 复性 延伸
PCR技术与DNA复制过程比较
—利用PCR技术扩增目的基因
项目 PCR技术 DNA复制 相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
第二步 基因表达载体的构建
目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；
同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
思考：各个元件有什么作用？
（核心工作）
第二步 基因表达载体的构建
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
启动子：
位置：基因的首端
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
位置：基因的尾端
功能：终止转录
标记基因：便于重组DNA分子的筛选。
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
DNA片段
DNA片段
mRNA上
三个相邻碱基
mRNA上
三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA
决定转录
的结束
翻译的
起始信号
决定翻译过程的结束
第二步：基因表达载体的构建
限制酶
限制酶
DNA
连接酶
质粒
重组
DNA分子
原理：基因重组
目的基因的获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
自主思考：将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法的原理是什么？各自适用于什么生物？
1.农杆菌转化法
（1）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
一
将目的基因导入植物细胞
（2）特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
（3）过程
2.花粉管通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
一
将目的基因导入植物细胞
花粉管通道法
3.基因枪法
单子叶植物中常用的一种基因转化方法，成本较高。
1.导入方法：
2.受体细胞:
显微注射技术
二
将目的基因导入动物细胞
受精卵
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
①体积大，易操作。
②易表现出全能性。
3.过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
三
将目的基因导入微生物细胞
1.常用方法：
Ca2+处理法
原核细胞（常选择大肠杆菌）
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
3.过程：
（目的）
2.受体细胞：
（优点）
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
增加细胞壁的通透性
大肠杆菌细胞
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
1.检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
一
分子水平的检测
方法:
DNA分子杂交技术
15N
15N
杂交DNA分子
探针（放射性同位素标记）
转基因生物的DNA
过程:
方法:
分子杂交技术
过程:
15N
15N
探针（放射性同位素标记）
转基因生物的mRNA
杂交双链
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法:
过程:
抗原-抗体杂交技术
若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
第四步：目的基因的检测与鉴定
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
二
个体生物学水平的鉴定
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
第四步：目的基因的检测与鉴定
习题巩固——用限制酶切割时需注意的事项
(1)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
√
×
×
练习与应用
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
D
3.下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是( )
A.检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因用DNA分子杂交的方法
B. 检测目的基因是否转录用分子杂交的方法
C. 检测目的基因是否表达用抗原-抗体杂交的方法
D. 目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤
D
巩 固 提 升
4.下列各项中能说明目的基因在受体细胞中完成表达的是 (　　 )
A.番茄叶肉细胞检测到鱼的抗冻蛋白基因
B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C.山羊乳腺细胞中检测到人抗凝血酶基因
D.酵母菌细胞中提取到人白细胞介素
D

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