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第2节 微生物的基本培养技术及应用
一 微生物的基本培养技术
第一章
微生物的概述
一
培养基的配制
二
无菌技术
三
微生物的纯培养
四
CONTENTS
目录
课堂总结与练习
五
经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，在经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，非常的方便！
从社会中来
家庭自制成功率低
葡萄酒、酸菜发霉变质
食用自制酸奶导致肠胃不适屡见不鲜
①制作工具和原料灭菌
②接种单一（纯）的菌种
③控制发酵条件
④避免杂菌进入
微生物的培养技术
那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
微生物的类群
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；
放线菌：链霉菌等
（1）细菌的形态
杆菌
球菌
霍乱弧菌
葡萄球菌
螺旋菌
若想通过肉眼能看到某种细菌，我们该怎么做？
必须对其进行分离纯化；
对微生物进行大量培养，致使其在培养基表面或内部形成菌落。
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成
肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
（2）微生物生长繁殖产生的菌落
沙门氏菌
毛霉
菌落是鉴定菌种的重要依据
实验室培养微生物条件
1）要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件
——培养基
2）要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。
——无菌技术、
微生物纯化培养
防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。
请结合教材P9-10面，小组合作并思考下列问题：
1.培养基的用途有哪些？
2.培养基的必备营养成分有哪些？
3.配制培养基时，如何满足不同微生物的特殊需求？举例说明。
4.培养基的种类有哪些？
1、培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
3、培养基类型：
固体
培养基
液体
培养基
有无琼脂
分离、
计数、
鉴定等
扩大培养、
连续培养、
工业生产
2、培养基作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
长有酵母菌菌落
盛有液体培养基
（ ①提供微生物繁殖所需各种营养， ②异养微生物的能源）
琼脂是一种从红藻中提取的多糖
琼脂在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。
碳源、氮源、无机盐、水
碳源
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等
自养微生物
异养微生物
功能：①构成细胞物质和一些代谢产物
②有机碳既是碳源又是能源。
氮源
无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等。
无机盐
功能：提供无机营养
调剂PH
维持渗透压
水
功能：良好的溶剂
维持生物大分子结构的稳定
4、培养基的基本成分：
pH、O2和特殊营养物质
例： 1、培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素；
2、培养霉菌时，需要将培养基调制酸性；
3、培养细菌时，需要将培养基调制中性或弱碱性；
4、培养厌氧微生物时，需要提供无氧条件
生长因子、氨基酸、维生素、碱基等
5、培养基的特殊条件：
培养基成分 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 氢元素、氧元素
牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）
牛肉膏
蛋白胨
牛肉膏是采用新鲜牛肉经过消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。
蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂。一般用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。
思考1.分析该培养基的营养构成，上述实例属于固体/液体培养基？
思考2.为什么培养基需要氮源？
请结合教材P10-11面，小组合作思考下列问题：
1.获得纯净培养物的关键是什么？
2.消毒和灭菌的区别是什么？
3.为了防止杂菌污染，具体措施有哪些？（四个方面）
4.如何针对不同的作用对象选择合适的消毒/灭菌方法？
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染！1.消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。2.灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。操作的空间、操作者的衣着和手用于培养微生物的器皿、接种用具和培养基-----与消毒最本质区别是指利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物的方法。类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物。强烈的理化方法，杀死所有微生物。煮沸消毒家庭餐具等生活用品100℃煮沸5～6min巴氏消毒牛奶等不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体（皮肤、伤口）、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基及多种器材和物品高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121 ℃,15～30min接种室、接种箱，超净工作台（迅速彻底）消 毒
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化学药剂
紫外线
灭 菌
涂布器
02
干热灭菌箱
高压蒸汽灭菌锅
灼烧灭菌
连一连：物品所对应的灭菌或消毒方法
培养基
培养皿
接种环
实验操作者的双手
实验室
牛奶
湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）
干热灭菌
灼烧灭菌
化学药剂消毒（酒精）
紫外线消毒
巴氏消毒法
预防接种前，常用酒精擦拭注射部位，这属于消毒还是灭菌？体积分数为75%和95%的酒精，哪种效果更好？为什么？
酒精擦拭属于消毒，酒精消毒时，75%的酒精杀菌效果最好。
浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，酒精分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。
联系生活——新冠病毒
2．常用方法： 法和 法。
微生物群
分散
单个细胞
单个菌落
繁殖
不同菌落的形状、大小、颜色等不同。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
1.概念：由 繁殖所获得的微生物群体是纯培养物，获得 的过程就是纯培养。
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
1.实验原理：
菌落
一个单菌落就是一个种群
鉴定菌种的重要依据：
形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。
如何鉴定哪个菌落是酵母菌？
问
获得单菌落的方法？
问
①平板划线法 ②稀释涂布平板法
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
接种和分离酵母菌
培养酵母菌
灭菌
倒平板
配制培养基
制备培养基
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
A、配制培养基
1、制备培养基
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
1、制备培养基
B.灭菌
包器材
03
【探究 实践】
酵母菌的纯培养
1、制备培养基
C、倒平板
注意
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
①温度：50℃左右
②操作：在酒精灯火焰附近
③冷凝后平板倒置
问
1.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
2、接种和分离
平板划线法
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
酵母菌的纯培养
1）留意接种环灭菌的注意事项。2）归纳划线的注意事项，并说明原因。
1
2
3
4
5
【平板划线法注意事项】
1.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次；
2.划线首尾不能相接；
3.每次划线前灼烧接种环进行灭菌；
4.划线操作结束后，仍需灼烧接种环。
连续划线法
分区划线法
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
杀死接种环上原有微生物。
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？
使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。
3、酵母菌培养
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-48h。
划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染.
用记号笔标记培养皿中菌落（皿底上）
平板划线法可以对菌种进行分离，不能对培养液中菌种进行计数
1.培养基的制作是否合格？
若未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
2.接种操作是否符合无菌要求？
若培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；若培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。
3.是否进行了及时细致的观察与记录？
培养12 h与24 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同。
（培养时间越长，菌落越大、颜色越深）
4、结果分析与评价
1. 微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制——降低食品的水分含量；
腌制——通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温储存——通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有________________。
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
培养皿和培养基
接种
洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2. 某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同，意味着培养条件有什么不同？
培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高，酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。

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