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第2章 细胞工程
动物细胞工程
动物细胞培养
动物细胞核移植
动物细胞融合
动物细胞工程
是最基础的技术
什么是动物细胞培养？动物细胞培养的作用？
皮肤的自体移植
灰绿色
小面积烧伤：患者通过切除 + 植皮(自身)后恢复
患者自身皮肤的不够用，如何解决？
大面积烧伤？
目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。
从社会中来
1）使用他人皮肤？
2）培养自身细胞？
怎样才能获得大量的自体健康皮肤？
如何用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？
一. 动物细胞培养
【思考】：动物组织的选择： 幼龄动物 or 老龄动物
幼龄个体的细胞分化程度低、分裂能力强，易培养。
从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
原理
地位
对象
目的
细胞有丝分裂
动物细胞工程的基础
获得细胞或者细胞产物
胚胎或幼龄动物的细胞
动物细胞培养所需的基本条件
营养物质
其他条件
<
<
糖类
氨基酸
无机盐
维生素
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
二、动物细胞培养的条件
动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件。你还记得有哪些条件吗？
充足的营养
稳定的内环境
体外培养动物细胞需要满足什么条件？
葡萄糖
氨基酸
无机盐
维生素
1、营养条件
【思考】：
培养基的类型： 固体培养基　or　液体培养基
合成培养基 or 天然培养基
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制的培养基
由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。
血清可以补充合成培养基中缺乏的物质，如蛋白质、
氨基酸、未知的促生长因子等。
？
动物血清
二、动物细胞培养的条件
二、动物细胞培养的条件
①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
②在无菌环境下进行操作
定期更换培养液
思考：为什么要定期更换培养液？
以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
无菌
无毒
2、无菌、无毒的环境
③添加一定量的抗生素
3、温度、pH和渗透压
一般与动物体内相同
①适宜的温度：
哺乳动物细胞培养的温度多以______________为宜；
36.5±0.5℃
②适宜的pH：
多数动物细胞生存的适宜pH为___________
7.2-7.4
③适宜的渗透压：
维持细胞正常的形态和功能
二、动物细胞培养的条件
二、动物细胞培养的条件
（1）气体组成及作用：
95%空气（O2）：
5%CO2：
细胞代谢所必需
维持培养液的pH
（2）具体操作：
通常采用培养皿或松盖培养瓶。
置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
CO2培养箱
培养皿
培养瓶
4、气体环境
三、动物细胞培养的过程
取动物组织
分散成单个细胞
细胞悬液
原代培养
用机械的方法， 或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理
加培养液
放入培养皿或培养瓶内
一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖（悬浮生长）
一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（贴壁生长）
细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液营养物质缺乏等分裂受阻
接触抑制
CO2培养箱中
传代培养：将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养
直接用离心法收集
重新用胰蛋白酶等处理分散成单个细胞，再用离心法收集
大多数细胞
三. 动物细胞培养的过程
（1）培养前，为什么要将动物组织分散成单个细胞？
①分散不会限制彼此的生长和增殖；
②利于从培养液中获得营养，排出代谢废物，利于继续培养。
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
动物组织
分散成
单个细胞
三. 动物细胞培养的过程
培养
（2）怎样将动物组织分散成单个细胞？
机械的方法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间。
①说明动物细胞间的物质主要是什么成分？
蛋白质
机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
不行。
思考：能不能用胃蛋白酶？
注意：
不能用胃蛋白酶将组织分散成单个细胞，因为胃蛋白酶的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活。
思考：胰蛋白酶可以将动物组织分散成单个细胞，使用时要注意什么问题呢？
注意：
动物细胞间的物质主要是蛋白质。使用胰蛋白酶时，应注意控制好作用时间。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，细胞膜也含有蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。
胰蛋白酶能将细胞消化掉，应注意时间的控制。
取动物组织
用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞
加培养液
制成细胞悬液
原代培养
在培养皿或培养瓶中
悬浮生长
贴壁生长
3.制细胞悬液，原代培养
将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。
①悬浮生长类：
能够悬浮在培养液中生长增殖。
需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。
②贴壁生长类：
体外培养的动物细胞类型
三、动物细胞培养的过程
细胞贴壁生长增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
培养皿
培养瓶
分瓶
原代培养
传代培养
细胞分裂受阻
悬浮生长
贴壁生长
密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等
原因
接触抑制
原因
解决办法
三、动物细胞培养的过程
接触抑制现象：细胞间相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加。
刚开始铺展贴壁生长
贴壁生长并进行有丝分裂
单层相互接触出现接触抑制
思考：悬浮生长细胞和贴壁生长细胞如何传代培养？
悬浮生长类细胞：
原代培养→分裂受阻→离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。
贴壁生长类细胞：
原代培养→分裂受阻→先胰蛋白酶处理→再离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。
【重要概念】
原代培养：指分瓶之前，动物组织经处理后的初次培养。
传代培养：分瓶后的细胞培养。
细胞贴壁：大多数细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。
正常细胞
平面观
（2）癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞。
肿瘤细胞
失去接触抑制
注意：
（1）正常细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，当细胞相互接触，细胞停止分裂增殖，数量不再增加，最后形成一层细胞。
正常细胞增殖到相互接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续增殖，出现接触抑制的现象。
癌细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，适宜条件下可以无限增殖。
思考：为什么癌变细胞没有接触抑制现象？
传代培养
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
放入CO2培养箱中培养
三、动物细胞培养的过程
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质
培养基特有成分
培养结果
培养目的
相同点 植物组织培养和动物细胞培养的比较
获得细胞或细胞产物
常用固体培养基
植物体
葡萄糖、动物血清
常用液体培养基
细胞增殖
细胞的全能性
许多细胞
快速繁殖等
蔗糖、植物激素
1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；
2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
03干细胞培养及其应用1.干细胞的概念：2.干细胞的来源：3.干细胞的类型：动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。在一定的条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。03早期胚胎中具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。胚胎干细胞分布特点应用实例在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等局限性必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。干细胞培养及其应用ES细胞成体组织或器官内造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）神经干细胞（神经系统中）精原干细胞（睾丸中）具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力成体干细胞分布举例特点应用实例治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病造血干细胞→神经干细胞→治疗细胞损伤造成的疾病03干细胞培养及其应用通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞①将特定基因或特定蛋白导入细胞（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）诱导多能干细胞概念制备方法应用优点②用小分子化合物诱导形成。①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展iPS细胞03干细胞培养及其应用移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
（5）诱导多能干细胞的应用：
取成纤维细胞
转入相关因子
细胞转化为iPS细胞
诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞
移植回病人体内
1. 判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。
（1）培养环境中需要O2，不需要CO2 。（ ）
（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（ ）
（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（ ）
（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（ ）
×
√
×
×
练习与应用（P47）
一、概念检测
练习与应用（P47）
2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是( )
A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞
B.造血干细胞可以分化为各种血细胞
C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的
D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用
A
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
二、拓展应用
（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？
该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。
无菌、无毒
营养
温度、pH和渗透压
气体环境
制备细胞悬液
原代培养
传代培养
动物细胞培养
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
干细胞的培养和应用
干细胞的种类、特点及应用
iPS细胞的培养和应用
课堂小结

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